Nosso protocolo expande o uso de G.mellonella de um modelo de infecção sistêmica para um modelo que permite a administração bacteriana através da rota oral natural. G.mellonella é um modelo de substituição adequado para roedores na análise de diferentes marcas de interações inatas de micro-pós, pois as larvas podem ser usadas para bactérias patogênicas humanas. Comece transferindo os ovos colocados por mariposas adultas para duas caixas de litro contendo substrato de mariposa de cera, a 30 graus Celsius, no escuro.
Após uma a duas semanas, transfira 25 gramas de larva contendo substrato em substrato fresco, quando pequenas e pequenas larvas se tornarem visíveis. Sincronizar as larvas após duas semanas de acordo com seu tamanho, em grupos de 30 a 40 larvas em novos recipientes de dois litros no substrato de mariposa de cera. Depois de duas semanas, selecione larvas para o experimento em peso.
Usando apenas larvas pálidas e rápidas com uma massa de 180 a 200 miligramas. Para forçar a alimentação das larvas, carregue uma seringa de insulina com uma agulha sem corte para aplicação oral, com uma vezes 10 a sétima bactéria por 10 microliters de DPBS por larva. Coloque a seringa em uma bomba de micro-seringa.
Aguarde que uma larva abra suas partes da boca antes de inserir a seringa cuidadosamente entre as mandíbulas e entregar as bactérias. Quando toda a larva for alimentada, incubar os animais no escuro a 37 graus Celsius, entre uma e 24 horas. Para o processamento de larvas, limpe uma capa de segurança com etanol e reagente de spray para evitar a contaminação da RNase.
Esto jato congele a larva viva em nitrogênio líquido. Homogeneize cada larva congelada individual usando uma argamassa e pilão e um pequeno volume de nitrogênio líquido. Quando um homogeneato em pó tiver sido produzido, transfira o homogeneado para um barco de espera descartável e espere que o nitrogênio líquido evapore.
Quando toda a larva tiver sido homogeneizada, misture os homogeneizados em pó com um mililitro de TRIzol em um tubo de dois mililitros. Incubar a mistura em temperatura ambiente por uma hora. No final da incubação, pelota o homogeneizar por centrifugação.
Transfira o supernatante para um novo tubo. Misture o supernatante com 200 microlitres de 1-Bromo-3-cloropropano, ou BCP. Vórtice e incubação por cinco minutos em temperatura ambiente, seguido de uma incubação de 10 minutos no gelo.
No final da segunda incubação, centrífuga a reação adicionada bcp e transferir a camada superior transparente para um novo tubo de dois mililitros. Precipitar o RNA da camada superior transferida com 500 microliters de isopropanol misturando e invertendo o tubo por cinco minutos. Em seguida, colete o RNA precipitado por centrifugação.
Lave a pelota de RNA precipitada com 500 microlitadores de 75% de etanol e seque o RNA por cinco a 10 minutos em temperatura ambiente. Quando o etanol evaporar, adicione 100 microliters de inibidor de ribonuclease em água sem nuclease à pelota seca de RNA, e cuidadosamente vórtice do tubo até que a pelota seja completamente dissolvida. Meça a qualidade e a quantidade do RNA por protocolos padrão, garantindo que a proporção de 260 a 280 seja aproximadamente duas, e a razão de 260 a 230 esteja na faixa de dois a 2,2.
Em seguida, use cinco microgramas do RNA isolado para digestão DNase e análise de expressão genética, de acordo com protocolos padrão. G.mellonella é capaz de limpar a força inicial alimentada com carga bacteriana até que nenhuma bactéria seja detectável. Com o número de cópias genéticas de 16s de B.vulgatus e E.coli diminuiu substancialmente em 24 horas.
A Commensal administrou uma larva g.mellonella induzir a expressão genética do RNA de vários genes marcadores de imunidade inata. Por exemplo, as moléculas de reconhecimento de LPS, apolipophorina e hemolina são geralmente expressas mais altamente nas larvas administradas por E.coli em comparação com larvas administradas por B.vulgatus. Além disso, a produção de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio são fortemente reguladas sobre a alimentação da força de E.coli em comparação com b.vulgatus, bem como a expressão genética antioxidativa GST.
Além disso, a expressão diferencial de peptídeo microbiano é induzida mais fortemente após a administração de E.coli do que em resposta à alimentação da força b.vulgatus. Lembre-se de usar apenas larvas saudáveis, brancas, em movimento rápido, para usar a paciência durante a alimentação forçada para evitar estressar as larvas e incluir todos os controles necessários. A ativação dos marcadores imunológicos G.mellonella pode ser determinada diretamente por ensaios de atividade RUS ou GST e a abundância de ANPs pode ser determinada por ensaios de inibição de crescimento bacteriano.
Esta técnica pode ser usada como uma ferramenta de triagem para bactérias commensais e patogênicas e para explorar simbiomas e pathobiomas intestinais sem sacrifício de muitos vertebrados. Use sempre os equipamentos de proteção individual adequados ao trabalhar com substâncias de nitrogênio líquido, BCP ou TRIzol.
