CR Harding foi apoiado pelo studentship WT086724 Wellcome Trust.

1. Preparação de L. pneumophila para a Infecção <ol><li> Prepare carvão de extracto de levedura (CYE) placas (carvão 2 g / L activada, 10 g / L de extracto de levedura, 13 g / L de agar, 10 g / L de N-(2-acetamido)-2-aminothanesulfonic ácido (ACES), 1 g / L α-cetoglutarato, 0,4 g / L de L-cisteína HCl e 0,25 g / l pirofosfato férrico, pH 6,9). Nota: Se for necessário, adicionar à canamicina (25 ug / ml) e / ou cloranfenicol (6 ug / ml) para placas de CYE. <ol><li> Realizar todos L. pneumophila trabalho a nível de contenção de biossegurança 2 (BSL-2) em um gabinete de segurança microbiana (MSC) em conformidade com as regras locais. </li></ol></li><li> Streak L. pneumophila de -80 ° C stocks de glicerol em placas CYE </li><li> Incubar as placas durante 4 dias a 37 ° C. Nota: A incubação das placas durante 4 dias aumenta significativamente a virulência de L. pneumophila em G. mellonella sobre incubação por 3 dias. </li><li> Um dia antes da infecção, ressuspender um fu laçoll de bactérias (contendo várias colónias) em 1 ml de pré-aquecido (37 ° C) ACES extracto de levedura (EJA) caldo e medir a absorvância a 600 nm (OD600) usando um espectrofotómetro. </li><li> Semear uma nova cultura de 3 ml EJA (com antibióticos, se necessário) para um final de OD 600 de 0,1. <ol><li> Incluir uma mídia só controlar para garantir a esterilidade da mídia. </li></ol></li><li> Incubar a 37 ° C numa incubadora com agitação a 200 rpm durante 21 horas. Nota: As bactérias devem ser cultivadas para a fase pós-exponencial para a infecção 38. Crescente por 21 hr permite experimentos a serem padronizados. Nota: Se for necessário para a indução da proteína, adicionar 0,5 mM de isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) durante a noite. </li><li> Medir o OD 600 (bactérias devem estar em fase de crescimento pós-exponencial, OD 600 2,5-3). </li><li> Dilui-se a cultura bacteriana para dar 1 x 10 9 CFU / ml em tampão fosfato salino estéril de Dulbecco (D-PBS). Nota: Com base nos resultados anteriores, uma OD 600 de 1 corresponde a 1 x 10 9 CFU / ml, no entanto, isto deve ser confirmado por diferentes L. cepas pneumophila. Nota: se for necessária a indução de uma proteína a partir de um plasmídeo, adicionar 1 mM de IPTG para o inoculo. </li><li> Placa do inoculo, tal como descrito na secção 9, como um controlo, para assegurar o CFU esperada está presente no inoculo. </li></ol> 2. Preparação de Larvas <ol><li> Compre suficiente G. mellonella larvas de um fornecedor comercial. As larvas são enviados na fase 5 º ou 6 º instar (aproximadamente entre 2-3 cm de comprimento) e são adequados para o uso imediatamente. Nota: Um método que descreve como a traseira larvas foi descrito previamente 39. Nota: As larvas podem ser armazenadas à temperatura ambiente até duas semanas, e não necessitam de alimentos. Descartar imediatamente qualquer larvas mostrando sinais de pupação. </li><li> Prepare o recipiente para larva por placção de um círculo de 10 cm de papel de filtro na parte inferior de um prato de 10 centímetros de Petri. </li><li> Com uma pinça sem corte, coloque dez larvas saudáveis ​​de tamanho aproximadamente semelhante na placa de Petri. Nota: Descarte insalubres insetos marrons colorido ou manchadas procurando. Larvas saudáveis ​​são uniformemente cremoso colorido, sem áreas de manchas escuras e são capazes de endireitar-se rapidamente se virou. </li></ol> 3. Infecção de G. mellonella Larvas <ol><li> Prepare a plataforma injecção gravando um círculo de papel de filtro para a superfície. </li><li> Segurança gravam uma dica P1000 horizontalmente para o papel de filtro para criar uma plataforma de injeção. Isto não necessita de ser estéril. </li><li> Esterilizar uma seringa de microtitulação de 20 ul por aspiração de etanol a 70% e incubando durante pelo menos 10 min. <ol><li> Usar luvas prova de punção enquanto está a injectar, </li></ol></li><li> Remova qualquer etanol residual por aspiração e expulsão de água estéril várias vezes. </li><li> Using a seringa, 10 ml de aspirado de L. pneumophila 1 x 10 9 suspensão UFC / ml. </li><li> Tome uma larva e suavemente, mas com firmeza transformá-lo em suas costas, inclinou-se sobre a ponta P1000. </li><li> Coloque a ponta da seringa sobre o proleg frente, à direita das larvas. </li><li> Gentilmente, insira a ponta da agulha no proleg, certificando-se de que ele está dentro das larvas, e suavemente injetar todo o conteúdo da seringa. Nota: Se a seringa está inserido corretamente, deve ser possível para pegar as larvas usando apenas a seringa para colocá-lo na câmara. <ol><li> Após injecção, as larvas observar durante alguns segundos. As larvas vão começar a engatinhar depois de alguns segundos, mas não deve excretar fluido. </li></ol></li><li> Resumidamente observar as larvas de algumas horas após a infecção; infecção com 10 7 CFU L. pneumophila 130b não causa sintomas nas primeiras 5-8 horas pi Portanto, se as larvas estão virando cinza / preto antes desse ponto, tele experimento deve ser interrompido. Nota: A inoculação de larvas com IPTG 1 mM não afecta a viabilidade das larvas ao longo do curso do experimento. </li><li> Do mesmo modo, injecta-se um total de 10 larvas por cada condição, incluindo 10 larvas injectadas com D-PBS para servir como um controlo para analisar a mortalidade das larvas. </li><li> Tape placas de Petri fechada e coloque em contenção secundária. </li><li> Incubar numa incubadora bacteriano padrão a 37 ° C, durante a duração da experiência. </li></ol> 4. O pré-tratamento das larvas com um inibidor químico <ol><li> Antes da infecção, as larvas se preparar para injecção, tal como descrito na secção de 3,1-3,6. </li><li> Injectar 10 mL de uma solução de citocalasina D 100 pM para a frente, para a esquerda proleg de 10 larvas. Nota: Inibidor é injectado num proleg diferente da suspensão bacteriana para reduzir o prejuízo para as larvas. </li><li> Injectar 10 mL de DMSO em 10 larvas como um controlo. </li><li> Incubar larvas em37 ° C durante 4 h. </li><li> Injetar larvas pré-tratados como descrito na seção 3 na frente, certo proleg com 1 x 10 7 UFC de L. WT pneumophila ou um controle PBS. </li></ol> 5. Análise da Mortalidade larval <ol><li> Aos 18 hr pós infecção (pi), examine todas as larvas infectadas para a mortalidade. </li><li> Para verificar a mortalidade, use uma pinça sem corte para virar as larvas e procurar o movimento das pernas, as larvas saudável deve endireitar-se rapidamente. Pigmentação indica uma reação imunológica forte à infecção. Se houver qualquer movimento, contam como vivo. </li><li> Número recorde de larvas mortas e vivas. </li><li> Repita esse processo em todos os outros pontos de tempo escolhido. Nota: Se a incubação continuou por mais de três dias, as pupas podem ser vistos. Remova qualquer pupas e eutanásia por congelamento a - 20 ° C antes de metamorfose pode ocorrer. </li></ol> 6. Extração de hemolinfa <ol><li> Aleatoriamente selecionar trêslarvas e colocar num tubo de 14 ml em pontos de tempo seleccionados, tais como 5 e 18 horas pi, </li><li> Colocar este tubo em gelo durante 5-10 minutos, até que nenhum movimento das pernas, as larvas podem ser observadas. </li><li> Coloque as larvas anestesiados para uma placa de Petri e, usando um bisturi, fazer uma incisão entre dois segmentos próximos da cauda das larvas. </li><li> Esprema as larvas em um tubo de centrífuga de 1,5 ml estéril para recolher a hemolinfa. <ol><li> Hemolinfa Piscina de pelo menos três indivíduos. Uma larva dá entre 15-50 mL de hemolinfa dependendo do tamanho. Nota: Durante a extracção, hemolinfa que é muito fácil para interromper o intestino, resultando na contaminação potencial das amostras. Reduzir a contaminação por corte as larvas perto da cauda (distância a partir do intestino), no entanto, a selecção de antibiótico será sempre necessária quando o plaqueamento as bactérias. Nota: Para evitar hemolinfa escureçam e coagulante, processo hemolinfa dentro de 10 minutos após a coleta. </li></ol></li><li> Descartar o corpo de larvas para um novo tubo de 14 ml de Falcon, de vedação e lugar, a - 20 ° C durante a noite para assegurar que as larvas estão mortas. </li><li> Autoclave larvas mortas e dispor de acordo com as regras locais. </li></ol> 7. Determinação da Viabilidade de hemócitos <ol><li> Extrair hemolinfa como descrito acima. </li><li> Misturar 20 ul de hemolinfa foi extraída com 20 mL de 0,02% (v / v) de azul de tripano em PBS em um poço de uma placa de 96 poços. </li><li> Incubar durante 5 min à temperatura ambiente. </li><li> Carga 10 mL de hemolinfa em um hemocitômetro e contar células (azul) não viáveis. </li><li> Conte cada amostra em triplicado para reduzir o erro. </li></ol> 8. Processamento de Extraído Hemócitos para imunofluorescência Microscopia <ol><li> Misture a hemolinfa reunidas extraída de, pelo menos, três larvas e pipeta para uma lamela de vidro de 10-15 mm de uma placa de 24 poços. Nota: Lamelas não necessitam de tratamento como hemócitos pode aderir ao vidro. </li><li> Adicionar 0,5 ml de D-PBS e misture bem por pipetagem cima e para baixo. </li><li> Centrifuga-se o prato durante 10 minutos a 500 xg, à temperatura ambiente (RT), utilizando um suporte de placa de centrífuga anti-aerossol. </li><li> Examine cada cavidade utilizando um microscópio invertido para verificar se os hemócitos aderiram. </li><li> Remover o sobrenadante e lava-se cuidadosamente as células três vezes por adição de 0,5 ml de D-PBS para a parede do poço, balançando o prato 2-3x e removendo o D-PBS com uma pipeta. </li><li> Fixar as células por adição de 0,5 ml de 4% (v / v) de paraformaldeído (PFA) em PBS. </li><li> Incubar as células de entre 20-30 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Lave as células três vezes com D-PBS, como antes. </li><li> Adicionar 0,5 ml de 15 mM NH 4 Cl em PBS para extinguir a PFA residual e incubar à temperatura ambiente durante 15 min. </li><li> Lave as células três vezes com D-PBS. Nota: Nesta fase, as lamelas podem ser armazenadas durante a noite a 4 ° C. </li><li> Adicionar 0,5 ml de 0,1% de Triton X-100 em PBS e incubar durante 5 min à temperatura ambiente para permeabilizar as células. </li&gt; <li> Bloco durante 1 hora com solução de bloqueio (2% (w / v) de BSA em PBS). </li><li> Incubar durante 1 hora à temperatura ambiente no escuro, com o anticorpo primário diluído em solução de bloqueio na diluição indicada pelo fabricante. </li><li> Lavar 3x com PBS. </li><li> Incubar durante 1 hora com o anticorpo secundário e DAPI para visualização de bactérias como acima. </li><li> Lavar 3x com PBS. </li><li> Montar as lamelas utilizando uma gota de reagente de montagem sobre lâminas de vidro. </li><li> Incubar durante a noite no escuro à temperatura ambiente para secar totalmente a solução de montagem. </li><li> Imagem desliza sobre um microscópio de fluorescência. </li></ol> 9. Quantificação de bacteriana CFU <ol><li> Adicione 100 g / ml spectinomicina para CYE placas para evitar a contaminação pela flora intestinal. L. 130b pneumophila tensão é naturalmente resistente à espectinomicina 40. </li><li> Antes de extração de hemolinfa, pesar 1,5 ml tubos de centrífuga. </li><li> Extraia hemolinfa como descrito na seção 6 e coloque em pesava tubes, adicionar 1 ml de 5 mg / ml de digitonina, misturar bem e incubar durante 5 min à temperatura ambiente para lisar os hemócitos. </li><li> Pesar novamente o tubo com hemolinfa e determinar o peso da hemolinfa extraída. </li><li> Realize dez diluições vezes de hemolinfa em mídia EJA estéril. </li><li> Usando uma caneta, divida a base de uma placa de CYE em seis sectores iguais e rótulo. </li><li> Placa de três gotas de 25 ul de cada diluição (começando com o mais diluído) em cada secção da placa. </li><li> Incubar as placas com as tampas Upmost durante a noite a 37 ° C. </li><li> Uma vez que as gotas secaram completamente, para girar a placa por cima e incubar a 37 ° C durante, pelo menos mais dois dias. </li><li> Quantificar as bactérias extraídas por contagem das colónias em cada diluição e normalizam-se ao peso da hemolinfa extraída. </li></ol> 10. Determinação do Índice Competitiva (IC) <ol><li> Confirme que ambas as cepas crescem igualmente bem em caldo de cultura e em placas de ágar CYE prior para tentar o índice competitivo. </li><li> Preparar suspensões bacterianas mutantes resistentes WT ou canamicina como descrito na seção 1 e misture em uma proporção de 1:1. <ol><li> Diluições em série da placa do inóculo para CYE espectinomicina (100 mg / ml) e CYE spectinomicina / canamicina </li></ol></li><li> Infectar larvas e extracto de hemolinfa em momentos adequados, tal como descrito acima. </li><li> Determinar a contagem de viáveis ​​por meio da extração de hemolinfa e chapeamento de diluições em série para spectinomicina CYE e CYE spectinomicina / canamicina. </li><li> Calcular o índice competitiva (IC), como se segue: IC = (saída de mutante / saída WT) / (inoculo mutante / WT inoculo). </li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O Galleria mellonella modelo larval para a infecção Legionella pneumophila é uma ferramenta útil para estudos in vivo de patogênese. Aqui mostra-se que um certo número de aspectos da infecção de macrófagos pode ser recapitulado no G. modelo mellonella, incluindo o papel do Dot / Icm T4BSS na virulência e replicação bacteriana e da localização do Dot / Icm efetuador SIDC. Além disso, demonstra-se que um inibidor químico de polimerização de actina reduz significativamente a mortalidade das larvas, que imita os resultados obtidos em macophages 47 e provas de que a internalização das bactérias é necessário para fazer com que a mortalidade das larvas. Anteriormente, demonstrou-se que as variações na virulência de L. cepas pneumophila visto em outros modelos de infecção pode ser verificado em G. mellonella e que a indução de fatores de virulência em fase de crescimento pós-exponencial é necessário para a virulência bacteriana <sup&gt; 36, confirmando que G. mellonella é um modelo adequado para L. infecção pneumophila. Determinando o CFU de L. pneumophila de larvas infectadas quer isoladamente ou em infecções mistas aumenta grandemente a utilidade do modelo. Anteriormente, vários fatores têm sido descoberto que têm efeitos sutis sobre replicação bacteriana em um ou mais modelos de infecção 29,48-51. Embora as larvas não possuem um sistema imunitário adaptativo, a presença da resposta imune inata proporciona selecção mais forte em comparação com os macrófagos sozinhos, o que pode servir para amplificar fenótipos subtis. Portanto, é possível que, enquanto essas cepas provavelmente não afetará significativamente a mortalidade larval, eles podem demonstrar diminuição da replicação bacteriana ou adequação no G. modelo mellonella. , Bem como a replicação de L. pneumophila nas larvas, mostramos esgotamento hemocyte significativa no final de infecção. Como L.pneumophila é esperado para lisar as células hospedeiras, no final do seu ciclo de replicação, medir o esgotamento de hemócitos também pode servir como uma medida indirecta da replicação bacteriana. Esgotamento hemócitos foi previamente correlacionado com a mortalidade de insetos em infecção 3,52, embora os resultados recentes sugerem que esta situação é mais complexa do que a primeira belived 37. Recentemente, demonstrou-se que a carência de larvas leva a um aumento da susceptibilidade à infecção por meio de uma supressão das respostas imunes 53. Nos ensaios aqui descritos, as larvas não foram alimentados durante a duração do estudo e não se sabe como bem larvas alimentadas com responderia a L. infecção pneumophila. Uma das vantagens de G. mellonella como um organismo modelo é a facilidade de extracção e quantificação de hemócitos de larvas infectadas. Vídeos anteriores demonstraram vários métodos para extração de hemócitos de insetos 54,55 no entanto, o conheceuhod aqui apresentada é simples e adequado para processamento imediato. Uma vez extraído, hemócitos pode ser facilmente quantificado, utilizado para imunofluorescência, a microscopia electrónica de transmissão 36 ou 56 por citometria de fluxo ou cultivadas e infectadas ex vivo 3 permitindo que a resposta das células à infecção a ser investigada em detalhe. Isto aumenta significativamente a flexibilidade do modelo. Uma ressalva para imunofluorescência em G. mellonella é a oferta limitada de anticorpos validados contra G. proteínas mellonella. No entanto, estudos têm demonstrado a criação de anticorpos contra as proteínas de larvas 57 e anticorpos contra as proteínas imuno-relacionadas humanos foram encontrados para reconhecer G. proteínas mellonella 11, demonstrando o potencial de imunofluorescência em G. hemócitos mellonella. A facilidade de G. infecção mellonella permite rápidos, telas de médio rendimento que poderiamser utilizado para comparar a virulência das várias espécies de Legionella e as estirpes e poderia ser utilizado para analisar ainda factores de virulência previamente identificados, tais como moléculas de adesão 58 ou o sistema de secreção de tipo 2 59, que são necessários para virulência em outros modelos. Além disso, a utilização deste modelo irá permitir a identificação e a caracterização adicional de novos factores de virulência incluindo as proteínas efectoras segregadas e translocados. Recentemente, tem sido mostrado que a actividade da fosfolipase C de L. pneumophila tem um papel em G. mellonella virulência 60 e que a proteína efectora Dot / Icm SdhA é necessária para a virulência 37. Além disso, foi demonstrado recentemente que existe uma correlação entre os fenótipos observados em G. mellonella e no camundongo linhagem A / J 37. Isto sublinha o valor desta ferramenta para complementar protozoário unicelular ambiental e de acolhimento e murimodelos de infecção ne. O G. mellonella modelo vai se tornar ainda mais valioso no futuro, uma vez que a seqüência genômica larval estará disponível e as ferramentas mais genéticos são estabelecidas. Passos nessa direção incluem a recente publicação que detalha o transcriptoma imune relacionados com 61 ea formação de uma iniciativa para avançar silenciamento gênico em Lepidoptera spp 62. Usando G. larvas mellonella, que tem uma série de leituras simples e rápidos de virulência bacteriana que podem ser utilizados para investigar a patogênese de L. pneumophila. Estabelecimento destes ensaios de triagem e mais ampla de L. cepas pneumophila sorogrupos e vai aumentar a utilidade desta nova ferramenta e vai contribuir para a nossa compreensão da L. patogênese pneumophila.

Os modelos animais de infecção provaram inestimável para a determinação de fatores de virulência bacteriana. No entanto, os modelos de invertebrados ganharam maior atenção como uma alternativa viável aos modelos tradicionais de mamíferos de infecção. As larvas da traça da cera, Galleria mellonella está cada vez mais a ser usado para estudar uma série de agentes patogénicos humanos importantes, incluindo bactérias Gram-positivas e Gram-1 negativas bactérias 2,3 e vários fungos patogénicos 4,5. Usando um modelo de insectos tem um número de vantagens em relação aos modelos de mamíferos tradicionais, como um invertebrado, G. mellonella não está sujeito às limitações éticas de modelos de mamíferos. Além disso, as larvas podem ser facilmente mantida, infectados por injecção, sem anestesia, são submetidos a pré-tratamento com inibidores químicos 6 e manter a incubação a 37 ° C 7. Curiosamente, uma boa correlação entre a patogenicidade de vários microorganismos em G. mellonella e modelos de infecção de mamíferos tem sido estabelecida 2,8. O aumento da compreensão do sistema imunológico de G. mellonella também ajudou na caracterização deste organismo modelo. Embora insetos não têm um sistema imunológico adaptativo como encontrado em mamíferos, eles têm defesas celulares e úmero sofisticadas, incluindo a produção de peptídeos antimicrobianos 9. Hemócitos são o principal mediador das defesas celulares e são o tipo de células mais numerosas encontrado na hemolinfa (ou sangue) de G. mellonella 10, Estas células são fagócitos profissionais e executar funções semelhantes a macrófagos e neutrófilos humanos por ambos tendo-se e degradar as bactérias num compartimento phago-lisossomal 10,11 e formando nódulos torno bactérias invasoras, restringir fisicamente a replicação bacteriana 12. Legionella pneumophila é um agente patogénico respiratório que provoca Pneumoni graveum (doença dos legionários) em populações suscetíveis, como idosos ou imunocomprometidos 13. Legionella é encontrado onipresente em fontes de água, tanto ambientais e antrópicos, onde é um patógeno de várias espécies de água doce amebas 14,15. Legionella sobrevive e replica dentro destes fagócitos profissionais utilizando um complexo multi-proteína conhecida como o Dot / Icm (defeituoso no tráfico organelo multiplicação / intracelular) do tipo 4 sistema de secreção (T4SS) para translocar mais de 275 proteínas efectoras dentro da célula hospedeira 16-20. Essas proteínas servem para subverter os caminhos normais fagocíticas célula hospedeira, levando à criação da Legionella contendo vacúolo (LCV). O LCV evita a fusão com os lisossomas e recruta vez do retículo endoplasmático (ER) de vesículas derivado, o que resulta em um compartimento especializado que se assemelha a RE rugoso 21,22. L. pneumophila é considerado um percurso humano acidentalogen; as mesmas estratégias que permitem replicar dentro de amebas, também permitir a replicação nos macrófagos alveolares humanos 23. Hospedeiros mamíferos têm sido caracterizadas como modelos para a infecção por Legionella humana, incluindo ratos e cobaias 24,25. No entanto, a maioria das estirpes de ratinhos são resistentes à infecção por Legionella 26 com a excepção de o consanguínea albino A / J de ratinho, o qual desenvolve um ligeiro, auto-limitante de infecção de 24. Embora o modelo de cobaia se assemelha mais de perto a doença humana 25, a falta de mutantes e aumento do custo desencoraja a sua utilização 27. Além disso, vários modelos de invertebrados têm sido desenvolvidos para a infecção por Legionella pneumophila incluindo Caenorhabditis elegans 28, Drosophila melanogaster 29 e várias espécies de amebas 30-32. No entanto, estes modelos têm fraquezas, virulência do C. elegans </em&gt; Sistema não é Dot / Icm-dependente 28, o que limita a utilidade deste modelo. O modelo de Drosophila revelou-se eficaz na investigação de fatores de virulência bacteriana 29 e parece ser promissor no entanto, este modelo não foi totalmente caracterizada. Amebas unicelulares são os anfitriões ambientais de L. pneumophila e são ideais para investigar a ação de fatores de virulência em um nível molecular 33 porém faltam várias importantes mediadores da resposta da célula hospedeiro mamífero para infecção, como caspases 34. Os pontos fracos dos modelos existentes, juntamente com o alto custo e as preocupações éticas relacionadas com a experimentação de mamíferos, tem levado à busca de outros organismos modelo apropriadas 29,35. Temos demonstrado recentemente que G. mellonella é um modelo adequado para L. pneumophila patogênese 36,37. Este protocolo detalha as técnicas experimentais utilizadas para infectarção G. larvas mellonella, analisando moralidade larval, extraindo hemócitos para contagem e imunofluorescência e determinar replicação viável UFC conta de larvas infectadas.

<table border="1">
 <tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Material/ Equipment</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>ACES yeast extract (AYE) broth</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4 g ACES, 4 g yeast extract, 0.4 g &alpha;-ketoglutarate, pH 6.9, 400 ml H2O, autoclaved, 4 ml iron solution*, 4 ml cysteine solution* 
		 *add sterile ingredients after autoclaving</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Charcoal buffered yeast extract (CYE) plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>As above, with the addition of 0.6 g activated charcoal and 6 g agar</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sterile iron solution (Ferric Pyrophosphate)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6526 </td>
			<td>0.6 mM solution, sterile filtered</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sterile cysteine solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7880</td>
			<td>3.3 mM solution, sterile filtered</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>G. mellonella (waxworms)</td>
			<td>Livefood UK</td>
			<td>W250</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti-HA-Tetramethyl Rhodamine Isothiocyanate (TRITC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9037</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti-Legionella LPS</td>
			<td>Cambridge Biosciences</td>
			<td>PA1-7227 </td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti-Rabbit IgG Alexa488</td>
			<td>Jackson Immunoreach</td>
			<td>711-485-152</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Isopropyl &beta;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I6758</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dulbeccos phosphate buffered saline (D-PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8662</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>R1026</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ammonium chloride (NH4Cl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9434</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Trypan Blue solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D141</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Cytochalasin D</td>
			<td>Biomol International</td>
			<td>BML-T109-0001</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
		 <td></td>
		 <td></td>
		 <td></td>
		 <td>[header]</td>
 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Material</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Microtiter Syringe</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>24544</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Cell counter, double, Improved Neubauer </td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0926</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For centrifuging plates </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any microscope with appropriate filters for the required fluorophores</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For viable cell counting </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Puncture-proof glove</td>
			<td>Turtleskin </td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
 </tbody>
 </table>

use of galleria mellonella as a model organism to study legionella pneumophila infection

Legionella pneumophila, o agente causador de uma pneumonia grave denominada doença do legionário, é um importante patógeno humano que infecta e replica dentro de macrófagos alveolares. A sua virulência depende do sistema Dot / Icm secreção de tipo IV (T4SS), que é essencial para estabelecer um vacúolo permissiva replicação conhecido como o vacúolo que contém a Legionella (LCV). L. infecção pneumophila pode ser modelado em ratos no entanto a maioria das linhagens de camundongos não são permissivas, levando à busca de modelos de infecção da novela. Mostrámos recentemente que as larvas da traça da cera Galleria mellonella são adequados para investigação de L. infecção pneumophila. G. mellonella é cada vez mais usado como um modelo de infecção por patógenos humanos e existe uma boa correlação entre a virulência de várias espécies bacterianas no inseto e em modelos de mamíferos. Um componente-chave de defesas imunológicas do larvas são hemócitos, profissãofagócitos ai, que ocupam e destroem invasores. L. pneumophila é capaz de infectar, formar um LCV e replicam no interior dessas células. Aqui demonstramos protocolos para analisar L. virulência pneumophila no G. modelo mellonella, incluindo como crescer L. infecciosa pneumophila, pré-tratamento das larvas com inibidores, infectar as larvas e como extrair células infectadas para quantificação e microscopia de imunofluorescência. Nós também descrevem a forma de quantificar a replicação bacteriana e fitness em ensaios de competição. Estas aproximações permitem o rápido rastreio de mutantes para determinar factores importantes em L. virulência pneumophila, descrevendo uma nova ferramenta para ajudar a nossa compreensão desse complexo patógeno.

Aqui é demonstrado que G. mellonella é um modelo apropriado, fácil de usar para estudar L. infecção pneumophila. Anteriormente, demonstrou-se que o L. virulência pneumophila em macrófagos, amebas e modelos de mamíferos é dependente da presença do sistema de secreção Dot / Icm 41-43. G. larvas mellonella foram infectadas tal como descrito acima e a virulência do tipo selvagem (WT) e uma estirpe de Dot / Icm deficiente comparado. A infecção com 10 7 CFU da L. 130b pneumophila esforço resultou em 100% de mortalidade dentro de 24 horas pós-infecção (pi). No entanto, a L. pneumophila Δ DOTA estirpe, que não tem um sistema de secreção Dot / Icm T4SS funcional, foi avirulenta neste ensaio (Figura 1). Isto demonstra que o L. virulência pneumophila em G. mellonella depende da translocação de efetores Dot / ICM, tornando este modelo adequado para caracterização dea função destas proteínas. Recentemente, foi mostrado que a inibição da fagocitose por tratamento citocalasina aumentou a susceptibly das larvas para a infecção pelos fungos Candida albicans 6. Como L. pneumophila é um agente patogénico intracelular, foi decidido determinar se a absorção das bactérias é crucial na sua patogénese neste modelo. As larvas foram pré-tratadas com 10 ul de 100 uM citocalasina D (CyD) durante 4 horas a 37 ° C, em seguida, infectadas com 10 7 CFU da L. WT 130b pneumophila e mortalidade monitorados em 24 horas pi O tratamento com o inibidor só não afetou a sobrevivência das larvas. No entanto, pré-tratado, as larvas infectadas apresentado sobrevivência significativamente maior (P = 0,0066, teste T desemparelhado) em comparação com tratados com DMSO, os insectos infectados (Figura 2). O efeito do tratamento CyD foi abolida por 48 hr pi (resultados não apresentados), o que pode ser devido à meia-vida do fármaco no G.mellonella. Isso demonstra que a absorção de L. pneumophila em G. mellonella hemócitos é um aspecto crucial da virulência bacteriana. A fim de validar expressão e determinar a localização subcelular de uma proteína efectora em G. mellonella, hemócitos foram extraídos e processados ​​para microscopia de imunofluorescência. As larvas foram infectadas com WT e Δ DOTA L. pneumophila 130b expressando um fragmento do efector T4SS bem definida, SIDC 41-918, fundido com quatro etiquetas HA N-terminal. Este efector, foi demonstrado que se ligam a LCV através de um domínio de fosfoinositido-4--fosfato de ligação 44. Utilizando anti-HA (vermelho) e de anti-Legionella (verde) anticorpos, 4HA-SIDC 41-918 localizada no LCV em hemócitos infectados (Figura 3). Esta localização foi previamente mostrado na discoideum amebas Dictyostelium e em macrófagos de mamíferos 44,45 confirmando o comparability deste modelo. A importância das proteínas de virulência é geralmente determinada por comparação da cinética de crescimento de tipo selvagem e as bactérias mutantes. De modo a seguir a cinética de replicação bacterianas durante o curso da infecção, três larvas foram sacrificados em cada ponto de tempo (0, 5, 18, e 24 h pi), a hemolinfa recolhidas e combinadas e o CFU/0.1g de hemolinfa extraída determinada. Depois de um mergulho inicial em 5 pi h, a UFC de bactérias WT aumenta até 24 horas pi no entanto, a estirpe Δ DOTA sofre nenhuma replicação e é eliminada a 18 hr pi (Figura 4). A capacidade de L. pneumophila para provocar a lise dos macrófagos de um modo dependente-T4SS tem sido documentada 46, no entanto, não há estudos semelhantes foram realizados in vivo. A concentração de hemócitos em circulação foi determinada aos 5, 18, e 24 hr pi larvas foram infectadas com WT ou Δ <em&gt; Dota L. pneumophila 130b, hemócitos extraídos de insetos infectados e células viáveis ​​contadas usando o método de exclusão do azul de tripan. Às 5 horas pi nenhuma diferença significativa na contagem de hemócitos entre as estirpes pode ser visto (Figura 5). No entanto, às 18 horas pi houve uma queda significativa na concentração de hemócitos no WT, mas não Δ Dota, larvas infectadas. Esta diferença persistiu às 24 horas pi A queda no número de hemócitos, combinada com a presença de bactérias intracelulares, como visto por imunofluorescência, sugere que L. pneumophila replica dentro hemócitos então lisa-los, permitindo que as bactérias se submeter a várias rodadas de replicação. <img alt="Figura 1" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/50964/50964fig1.jpg" /> Figura 1. A infecção com L. pneumophila induz Dot / Icm-dependente de mortalidade das larvas. de 10 larvas infectadas com PBS sozinho ou 10 <sup&gt; 7 UFC de tipo selvagem (WT) ou Δ Dota L. pneumophila 130b, incubados a 37 ° C durante 72 horas e no momento da morte das larvas gravado. Todas as larvas infectadas com o WT sucumbiu a uma infecção dentro de 24 horas pós-infecção (pi), no entanto nenhuma mortalidade foi observada em larvas inoculadas com PBS sozinho ou a tensão Δ Dota. Os resultados são a média de três experiências separadas, ± desvio-padrão. <img alt="Figura 2" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/50964/50964fig2.jpg" /> Figura 2. A mortalidade é dependente da internalização bacteriana. De 10 L. pneumophila larvas foram pré-tratadas com 10 ul de 100 uM citocalasina D (CyD) durante 4 horas a 37 ° C, em seguida, infectadas com 10 7 WT e mortalidade monitorizada a 24 hr pi larvas pré-tratado demonstraram significativamente (P = 0,0066, teste t ímpar) reduzida mortalidade. Os resultados representam a mean de em quatro experimentos independentes ± desvios-padrão com 10 larvas por condição. <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50964/50964fig3.jpg" /> Figura 3. Imunofluorescência de imagens de proteínas efectoras em hemócitos extraídos. Hemócitos foram extraídos a partir de larvas infectadas com L. pneumophila 130b WT ou Δ Dota expressar 4HA-SIDC 41-918 em 5 hr pi As células foram coradas com anti-HA (vermelho) e anti-Legionella (verde) anticorpos e mancha DNA DAPI (azul) para visualizar os núcleos. 4HA-SIDC 41-918 foi observada WT circundante, mas não Δ Dota, bactérias. Barra de escala de 5 mM. <img alt="Figura 4" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/50964/50964fig4.jpg" /> Figura 4. L. pneumophila replica dentro G. mellonella de um modo Dot / Icm-dependente. larvas foram infectadas com pneumophila WT ou Δ DOTA L. e a 0, 5, 18, ​​e 24 hr pi da hemolinfa de três insectos infectadas reunidas, colocadas em placas de CYE e o CFU determinada e normalizada para o inoculo e com o peso de hemolinfa extraída. WT L. pneumophila replicado ao longo do experimento, enquanto a tensão Δ Dota foi liberado dentro de 18 horas pi Os resultados são a média de três experimentos separados ± desvio padrão. <img alt="Figura 5" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/50964/50964fig5.jpg" /> Figura 5. Infecção com WT L. Resultados pneumophila em destruição de hemócitos significativa. Hemócitos foram extraídos a 5, 18, ​​e 24 hr pi de larvas infectadas com pneumophila WT ou Δ DOTA L. e contadas as células viáveis ​​utilizando um hemocitómetro. Nenhuma diferença nanúmero de células foi observada em 5 horas pi entre as cepas porém em 18 horas pi apenas aproximadamente 15% dos hemócitos em larvas permanecem infectados com a cepa WT em comparação com a cepa Δ Dota. Os resultados são a média de três experiências separadas, ± desvio-padrão.

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Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

A larva da cera traça Galleria mellonella foi recentemente estabelecido como um modelo in vivo para estudar a infecção Legionella pneumophila. Aqui, nós demonstramos técnicas fundamentais para caracterizar a patogênese da Legionella nas larvas, incluindo a inoculação, a medida da virulência bacteriana e replicação, bem como extração e análise de hemócitos infectados.

Utilização de<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Como um organismo modelo para estudar<em&gt; Legionella pneumophila</em&gt; Infecção

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

40.0K visualizações.  Imperial College London.  A larva da cera traça Galleria mellonella foi recentemente estabelecido como um modelo in vivo para estudar a infecção Legionella pneumophila. Aqui, nós demonstramos técnicas fundamentais para caracterizar a patogênese da Legionella nas larvas, incluindo a inoculação, a medida da virulência bacteriana e replicação, bem como extração e análise de hemócitos infectados. 

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Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

Apresentando tensão de cisalhamento em o Estudo da adesão bacteriana

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Imunologia e Infecção

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

There is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from cystic fibrosis (CF) patients. Existing methods rely on single or a few isolates grown aerobically and planktonically. Predetermined cut-offs are used to define whether the bacteria are sensitive or resistant to any given antibiotic1. However, during chronic lung infections in CF, P. aeruginosa populations exist in biofilms and there is evidence that the environment is largely microaerophilic2. The stark difference in conditions between bacteria in the lung and those during diagnostic testing has called into question the reliability and even relevance of these tests3.
 Artificial sputum medium (ASM) is a culture medium containing the components of CF patient sputum, including amino acids, mucin and free DNA. P. aeruginosa growth in ASM mimics growth during CF infections, with the formation of self-aggregating biofilm structures and population divergence4,5,6. The aim of this study was to develop a microtitre-plate assay to study antimicrobial susceptibility of P. aeruginosa based on growth in ASM, which is applicable to both microaerophilic and aerobic conditions.
 An ASM assay was developed in a microtitre plate format. P. aeruginosa biofilms were allowed to develop for 3 days prior to incubation with antimicrobial agents at different concentrations for 24 hours. After biofilm disruption, cell viability was measured by staining with resazurin. This assay was used to ascertain the sessile cell minimum inhibitory concentration (SMIC) of tobramycin for 15 different P. aeruginosa isolates under aerobic and microaerophilic conditions and SMIC values were compared to those obtained with standard broth growth. Whilst there was some evidence for increased MIC values for isolates grown in ASM when compared to their planktonic counterparts, the biggest differences were found with bacteria tested in microaerophilic conditions, which showed a much increased resistance up to a &gt;128 fold, towards tobramycin in the ASM system when compared to assays carried out in aerobic conditions.
 The lack of association between current susceptibility testing methods and clinical outcome has questioned the validity of current methods3. Several in vitro models have been used previously to study P. aeruginosa biofilms7, 8. However, these methods rely on surface attached biofilms, whereas the ASM biofilms resemble those observed in the CF lung9 . In addition, reduced oxygen concentration in the mucus has been shown to alter the behavior of P. aeruginosa2 and affect antibiotic susceptibility10. Therefore using ASM under microaerophilic conditions may provide a more realistic environment in which to study antimicrobial susceptibility.

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Current diagnostic antimicrobial susceptibility testing relies on the planktonic growth of isolates in nutrient rich, aerobic conditions. Here, we employ an alternative artificial sputum medium to study antimicrobial susceptibility of Pseudomonas aeruginosa biofilms under both aerobic and microaerophilic conditions more representative of the cystic fibrosis lung.

Uso de meio de escarro Artificial para testar a eficácia antibiótica contra<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Em condições mais relevantes para o Pulmão Fibrose Cística

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis

The study of bacterial virulence often requires a suitable animal model. Mammalian models of infection are costly and may raise ethical issues. The use of insects as infection models provides a valuable alternative. Compared to other non-vertebrate model hosts such as nematodes, insects have a relatively advanced system of antimicrobial defenses and are thus more likely to produce information relevant to the mammalian infection process. Like mammals, insects possess a complex innate immune system1. Cells in the hemolymph are capable of phagocytosing or encapsulating microbial invaders, and humoral responses include the inducible production of lysozyme and small antibacterial peptides2,3. In addition, analogies are found between the epithelial cells of insect larval midguts and intestinal cells of mammalian digestive systems. Finally, several basic components essential for the bacterial infection process such as cell adhesion, resistance to antimicrobial peptides, tissue degradation and adaptation to oxidative stress are likely to be important in both insects and mammals1. Thus, insects are polyvalent tools for the identification and characterization of microbial virulence factors involved in mammalian infections.
Larvae of the greater wax moth Galleria mellonella have been shown to provide a useful insight into the pathogenesis of a wide range of microbial infections including mammalian fungal (Fusarium oxysporum, Aspergillus fumigatus, Candida albicans) and bacterial pathogens, such as Staphylococcus aureus, Proteus vulgaris, Serratia marcescens Pseudomonas aeruginosa, Listeria monocytogenes or Enterococcus faecalis4-7. Regardless of the bacterial species, results obtained with Galleria larvae infected by direct injection through the cuticle consistently correlate with those of similar mammalian studies: bacterial strains that are attenuated in mammalian models demonstrate lower virulence in Galleria, and strains causing severe human infections are also highly virulent in the Galleria model8-11. Oral infection of Galleria is much less used and additional compounds, like specific toxins, are needed to reach mortality.
G. mellonella larvae present several technical advantages: they are relatively large (last instar larvae before pupation are about 2 cm long and weight 250 mg), thus enabling the injection of defined doses of bacteria; they can be reared at various temperatures (20 &deg;C to 30 &deg;C) and infection studies can be conducted between 15 &deg;C to above 37 &deg;C12,13, allowing experiments that mimic a mammalian environment. In addition, insect rearing is easy and relatively cheap. Infection of the larvae allows monitoring bacterial virulence by several means, including calculation of LD5014, measurement of bacterial survival15,16 and examination of the infection process17. Here, we describe the rearing of the insects, covering all life stages of G. mellonella. We provide a detailed protocol of infection by two routes of inoculation: oral and intra haemocoelic. The bacterial model used in this protocol is Bacillus cereus, a Gram positive pathogen implicated in gastrointestinal as well as in other severe local or systemic opportunistic infections18,19.

The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis

Oral and intra haemocolic infection of larvae of the greater wax moth Galleria mellonella is described. This insect can be used to study virulence factors of entomopathogenic as well as mammalian opportunistic bacteria. Rearing of the insects, methods of infection and examples of in vivo analysis are described.

O inseto<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Como um modelo de infecção poderosa para investigar Patogênese Bacteriana

The study of bacterial virulence often requires a suitable animal model. Mammalian models of infection are costly and may raise ethical issues. The use of ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the phenotypic and functional differences between murine and human monocyte-derived macrophages. Therefore, we here describe an in vitro model to generate and study primary human macrophages. Briefly, after density gradient centrifugation of peripheral blood drawn from a forearm vein, monocytes are isolated from peripheral blood mononuclear cells using negative magnetic bead isolation. These monocytes are then cultured for six days under specific conditions to induce different types of macrophage differentiation or polarization. The model is easy to use and circumvents the problems caused by species-specific differences between mouse and man. Furthermore, it is closer to the in vivo conditions than the use of immortalized cell lines. In conclusion, the model described here is suitable to study macrophage biology, identify disease mechanisms and novel therapeutic targets. Even though not fully replacing experiments with animals or human tissues obtained post mortem, the model described here allows identification and validation of disease mechanisms and therapeutic targets that may be highly relevant to various human diseases.

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages are important cells of the innate immune system. Here, we describe an easy to use in vitro model to generate these cells. Using gradient centrifugation, negative bead isolation and specific cell culture conditions, monocyte-derived macrophages can be generated for phenotypic and functional studies.

Um<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo para estudar a heterogeneidade de diferenciação de macrófagos humanos e Polarização

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

Cecal Ligation and Puncture-induced Sepsis as a Model To Study Autophagy in Mice

Experimental sepsis can be induced in mice using the cecal ligation and puncture (CLP) method, which causes polymicrobial sepsis. Here, a protocol is provided to induce sepsis of varying severity in mice using the CLP technique. Autophagy is a fundamental tissue response to stress and pathogen invasion. Two current protocols to assess autophagy in vivo in the context of experimental sepsis are also presented here. (I) Transgenic mice expressing green fluorescence protein (GFP)-LC3 fusion protein are subjected to CLP. Localized enhancement of GFP signal (puncta), as assayed either by immunohistochemical or confocal assays, can be used to detect enhanced autophagosome formation and, thus, altered activation of the autophagy pathway. (II) Enhanced autophagic vacuole (autophagosome) formation per unit tissue area (as a marker of autophagy stimulation) can be quantified using electron microscopy. The study of autophagic responses to sepsis is a critical component of understanding the mechanisms by which tissues respond to infection. Research findings in this area may ultimately contribute towards understanding the pathogenesis of sepsis, which represents a major problem in critical care medicine.

Experimental sepsis can be induced in mice using the cecal ligation and puncture (CLP) method. Current protocols to assess autophagy in vivo in the context of CLP-induced sepsis are presented here: A protocol for measuring autophagy using (GFP)-LC3 mice, and a protocol for measuring autophagosome formation by electron microscopy.

Cecal ligadura e punção induzida Sepsis como um modelo para estudar a autofagia em Ratos

Experimental sepsis can be induced in mice using the cecal ligation and puncture (CLP) method, which causes polymicrobial sepsis. Here, a protocol is ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote its motility and dissemination. New work has shown that proteins involved in actin-based motility are also linked to autophagy, an intracellular degradation process crucial for cell autonomous immunity. Strikingly, host cells may prevent actin-based motility of S. flexneri by compartmentalizing bacteria inside &#8216;septin cages&#8217; and targeting them to autophagy. These observations indicate that a more complete understanding of septins, a family of filamentous GTP-binding proteins, will provide new insights into the process of autophagy. This report describes protocols to monitor autophagy-cytoskeleton interactions caused by S. flexneri in vitro using tissue culture cells and in vivo using zebrafish larvae. These protocols enable investigation of intracellular mechanisms that control bacterial dissemination at the molecular, cellular, and whole organism level.

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

To counteract pathogen dissemination, host cells reorganize their cytoskeleton to compartmentalize bacteria and induce autophagy. Using Shigella infection of tissue culture cells, host and pathogen determinants underlying this process are identified and characterized. Using zebrafish models of Shigella infection, the role of discovered molecules and mechanisms are investigated in vivo.

Utilização de<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Para estudar interações Autophagy-Cytoskeleton

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening possibilities. They can be used to bridge the gap between cell based assays at earlier stages and in vivo validation in mammalian models, reducing, in this way, the number of compounds passing through to testing on the much more expensive rodent models. In this light, in the present manuscript is described a new high throughput pipeline using zebrafish as in vivo model system for the study of Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum infection. This setup allows the generation and analysis of large number of synchronous embryos homogenously infected. Moreover the flexibility of the pipeline allows the user to easily implement other platforms to improve the resolution of the analysis when needed. The combination of the zebrafish together with innovative high throughput technologies opens the field of drug testing and discovery to new possibilities not only because of the strength of using a whole animal model but also because of the large number of transgenic lines available that can be used to decipher the mode of action of new compounds.

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

This video article describes the high throughput pipeline that has been successfully established to infect and analyze large numbers of zebrafish embryos providing a new powerful tool for compound testing and drug discovery using a whole animal vertebrate organism.

Criação e Otimização de um Setup de Alto Rendimento para o Estudo<em&gt; Staphylococcus epidermidis</em&gt; E<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt; Infecção como um modelo para a Descoberta de Drogas

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and frequently of indigenous origin. The ability of some anaerobic pathogens to invade human cells gives them adaptive measures to escape innate immunity as well as to modulate host cell behavior. However, ensuring that the anaerobic bacteria are live during experimental investigation of the events may pose challenges. Porphyromonas gingivalis, a Gram-negative anaerobe, is capable of invading a variety of eukaryotic non-phagocytic cells. This article outlines how to successfully culture and assess the ability of P. gingivalis to invade human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). Two protocols were developed: one to measure bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize bacteria interacting with host cells. These techniques necessitate the use of an anaerobic chamber to supply P. gingivalis with an anaerobic environment for optimal growth.
The first protocol is based on the antibiotic protection assay, which is largely used to study the invasion of host cells by bacteria. However, the antibiotic protection assay is limited; only intracellular bacteria that are culturable following antibiotic treatment and host cell lysis are measured. To assess all bacteria interacting with host cells, both live and dead, we developed a protocol that uses fluorescent microscopy to examine host-pathogen interaction. Bacteria are fluorescently labeled with 2&#39;,7&#39;-Bis-(2-carboxyethyl)-5-(and-6)-carboxyfluorescein acetoxymethyl ester (BCECF-AM) and used to infect eukaryotic cells under anaerobic conditions. Following fixing with paraformaldehyde and permeabilization with 0.2% Triton X-100, host cells are labeled with TRITC phalloidin and DAPI to label the cell cytoskeleton and nucleus, respectively. Multiple images taken at different focal points (Z-stack) are obtained for temporal-spatial visualization of bacteria. Methods used in this study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

This article presents two protocols: one to measure anaerobic bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize anaerobic bacteria interacting with host cells. This study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

Porphyromonas gingivalis como um organismo modelo para a Avaliação da Interação de bactérias anaeróbias com células do hospedeiro

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and ...

Zebrafish as a Model to Assess the Teratogenic Potential of Nitrite

High nitrate levels in the environment may&#160;result in congenital defects or miscarriages in humans. Presumably, this is due to the conversion of nitrate to nitrite by gut and salivary bacteria. However, in other mammalian studies, high nitrite levels do not cause birth defects, although they can lead to poor reproductive outcomes. Thus, the teratogenic potential of nitrite is not clear. It would be useful to have a vertebrate model system to easily assess teratogenic effects of nitrite or any other chemical of interest. Here, we demonstrate the utility of zebrafish (Danio rerio) to screen compounds for toxicity and embryonic defects. Zebrafish embryos are fertilized externally and have rapid development, making them a good model for teratogenic studies. We show that increasing the time of exposure to nitrite negatively affects survival. Increasing the concentration of nitrite also adversely affects survival, whereas nitrate does not. For embryos that survive nitrite exposure, various defects can occur, including pericardial and yolk sac&#160;edema, swim bladder noninflation, and craniofacial malformation. Our results indicate that the zebrafish is a convenient system for studying the teratogenic potential of nitrite. This approach can easily be adapted to test other chemicals for their effects on early vertebrate development.

Exposure to teratogens may cause birth defects. Zebrafish are useful for determining the teratogenic potential of chemicals. We demonstrate the utility of zebrafish by exposing embryos to various levels of nitrite and also at different times of exposure. We show that nitrite can be toxic and cause severe developmental defects.

Peixe-zebra como um modelo para avaliar o potencial teratogênico de nitrito

High nitrate levels in the environment may&#160;result in congenital defects or miscarriages in humans. Presumably, this is due to the conversion of ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or directly into another cell, Gram-negative bacteria can also form outer membrane vesicles (OMVs). These membrane vesicles can deliver their cargo over long distances, and the cargo is protected from degradation by proteases and nucleases. 
Legionella pneumophila (L. pneumophila) is an intracellular, Gram-negative pathogen that causes a severe form of pneumonia. In humans, it infects alveolar macrophages, where it blocks lysosomal degradation and forms a specialized replication vacuole. Moreover, L. pneumophila produces OMVs under various growth conditions. To understand the role of OMVs in the infection process of human macrophages, we set up a protocol to purify bacterial membrane vesicles from liquid culture. The method is based on differential ultracentrifugation. The enriched OMVs were subsequently analyzed with regard to their protein and lipopolysaccharide (LPS) amount and were then used for the treatment of a human monocytic cell line or murine bone marrow-derived macrophages. The pro-inflammatory responses of those cells were analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay. Furthermore, alterations in a subsequent infection were analyzed. To this end, the bacterial replication of L. pneumophila in macrophages was studied by colony-forming unit assays. 
Here, we describe a detailed protocol for the purification of L. pneumophila OMVs from liquid culture by ultracentrifugation and for the downstream analysis of their pro-inflammatory potential on macrophages.

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Here, we describe the purification of Legionella pneumophila (L. pneumophila) outer membrane vesicles (OMVs) from liquid cultures. These purified vesicles are then used for the treatment of macrophages to analyze their pro-inflammatory potential.

Legionella pneumophila Outer Membrane vesículas: Isolamento e Análise do seu potencial pró-inflamatórios em macrófagos

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...