O objetivo geral deste procedimento é fornecer um método para avaliar a atividade de quinase LRRK2 endógena no sangue periférico humano. Isso é conseguido monitorando a fosforilação mediada pela LRRK2 de proteínas Rab, empregando anticorpos monoclonais rab específicos da Fundação Michael J.Fox. Aqui, focamos em neutrófilos periféricos humanos como uma constituição de população homogênea do local com altos níveis de expressão tanto de Rab2 quanto de Rab10.
O isolamento de neutrófilos baseia-se em uma seleção negativa que dentro de 40 minutos de ação finalizada permite o isolamento de 99% de neutrófilos puros e viáveis, ao mesmo tempo em que produz alta quantidade de níveis de proteína. Colete 10 mililitros de sangue em um tubo de coleta de sangue. Misture suavemente invertendo tubos sete a oito vezes.
Transfira 10 mililitros de sangue para um tubo cônico de 50 mililitros. Adicione ao sangue 100 microliters da solução de estoque EDTA 1, 0.1 molar EDTA PBS Solution, misture suavemente. Adicione 500 microliters coquetel de isolamento, 50 microliters por mililitro do kit de isolamento de neutrófilos para toda a amostra de sangue.
Vórtice as contas magnéticas do kit de isolamento de neutrófilos por 30 segundos antes de usar, a fim de resuspend contas magnéticas muito finas. Adicione 500 contas magnéticas de microliters à amostra de sangue e misture suavemente invertendo o tubo várias vezes. Incubar em temperatura ambiente por cinco minutos.
Topo do tubo até 50 mililitros com solução de estoque EDTA 2. Esta é uma solução milimólar EDTA PBS. Misture por tubos muito suavemente para cima e para baixo duas a três vezes.
Coloque o tubo no ímã e remova a tampa para evitar a agitação subsequente do tubo. Incubar por 10 minutos em temperatura ambiente. Suspensão celular cuidadosamente enriquecida com pipeta que contém neutrófilos em um novo tubo cônico de 50 mililitros.
Não toque na lateral do tubo que está em contato com o ímã e evite a coleta e perturbação dos glóbulos vermelhos na parte inferior do tubo. Deixe aproximadamente 10 mililitros da suspensão dos glóbulos vermelhos para trás na parte inferior do tubo. Contas magnéticas de vórtice durante 30 segundos antes do uso e adicionam contas magnéticas de 0,5 mililitro ao tubo contendo os neutrófilos enriquecidos.
Misture suavemente invertendo o tubo. Incubar em temperatura ambiente por cinco minutos. Coloque o tubo no ímã e remova a tampa para evitar agitação subsequente.
Incubar por cinco minutos em temperatura ambiente. Pipeta cuidadosamente a suspensão celular enriquecida que contém neutrófilos em um novo tubo cônico de 50 mililitros. Não toque na lateral do tubo que está em contato com o ímã.
Deixe aproximadamente cinco mililitros da suspensão na parte inferior do tubo. Para garantir a remoção completa das contas magnéticas da mistura celular, coloque o tubo contendo células enriquecidas no ímã. Incubar por 10 minutos em temperatura ambiente.
Pipeta cuidadosamente a suspensão celular enriquecida que agora contém neutrófilos puros em um novo tubo cônico de 50 mililitros. Não toque na lateral do tubo que está em contato com o ímã. Deixe aproximadamente cinco mililitros de suspensão na parte inferior do tubo.
Cubra células isoladas com uma solução de estoque EDTA mililitro 2 a um volume final de aproximadamente 41 mililitros. Pipeta para cima e para baixo para misturar. Divida a solução igualmente em dois tubos com aproximadamente 20 mililitros em cada tubo.
Centrifugar ambos os tubos a 335G por cinco minutos. Durante a etapa de centrifugação, pegue o estoque inibidor MLi-2, 200 micromolar cortar concentração de 1000X do congelador de menos 80 graus e deixar à temperatura ambiente para uso subsequente. Imediatamente após o passo de centrifugação e sem agitação dos tubos, despeje o sobrenante sem perturbar as pelotas de neutrófilo.
resuspenque cada pelota de célula em 10 mililitros de cultura celular em temperatura ambiente, encanar suavemente células para cima e para baixo quatro vezes. Rotule um tubo DMSO e o outro tubo MLi-2. Ao tubo rotulado DMSO adicione 10 microliteres de DMSO e adicione 10 microliters de 200 micromolar solução de estoque MLi-2, tubos suavemente para cima e para baixo para misturar.
Incubar amostras por 30 minutos em temperatura ambiente. Misture suavemente por inversão a cada 10 minutos durante o período de incubação. Durante o tratamento inibidor de quinase LRRK2 de 30 minutos remova a solução de caldo DIFP molar de 0,5 molar do congelador de menos 80 graus e coloque na capa de fumaça no gelo.
Em seguida, mova um miligrama por mililitro solução de estoque microcystin-LR a partir do congelador de menos 80 graus e coloque em temperatura ambiente para descongelar. Descongele uma alíquota, 0,25 mililitro do tampão de lise tirando-o do congelador, deixe descongelar à temperatura ambiente e, em seguida, coloque-o no gelo para uso subsequente. Prepare um mililitro de meio RPMI contendo um microliter de DMSO chamado de DMSO Resuspension Buffer.
Prepare um mililitro de meio RPMI contendo um microliter de 200 mli-2 ou inibidor alternativo de quinase LRRK2 e chame este Buffer de Resuspensão MLi-2. Após o período de incubação de 30 minutos, centrifugar ambos os tubos a 335G por cinco minutos, como antes. Descarte cuidadosamente o supernatante em cada tubo sem perturbar a pelota de neutrófilo.
Para o tubo rotulado DMSO, resuspende suavemente a pelota em um mililitro de Buffer de Resuspensão DMSO. E para o tubo rotulado MLi-2, resuspend pelotas em um mililitro de MLi-2 Resuspension Buffer. Transfira as pelotas de células resuspendadas para tubos de centrifugação correspondentes rotulados DMSO e MLi-2 e centrífugue ambos os tubos a 335G por três minutos.
Durante a etapa de centrifugação, prepare o tampão de lise. Na capa de fumaça, adicione cuidadosamente 0,25 microliters de solução DIFP molar de 0,5, bem como 0,25 microliters de um miligrama por mililitro microcystin-LR ao tampão de 0,25 mililitro de lise. Misture e deixe no gelo até usar.
Imediatamente após a centrifugação, remova cuidadosamente e completamente todos os supernacantes com uma pipeta sem perturbar a pelota de neutrófilo e coloque tubos no gelo. Adicione imediatamente 100 microliters de tampão de lise contendo DIFP e microcistina-LR a cada tubo. Usando uma pipeta de 100 a 200 microliter, resuspense as pelotas de células pipetando para cima e para baixo cerca de cinco a dez vezes.
Deite células no gelo por 10 minutos. Em seguida, tubos de centrífugas a 20.000 vezes G por 15 minutos a quatro graus celsius para remover detritos celulares. Transfira dmso e supernasal MLi-2 contendo lises neutrófilos em novos tubos de centrifugação.
Descarte pelotas de detritos. Os lises de neutrófilos estão agora prontos para uso ou podem ser congelados em nitrogênio líquido e armazenados a menos 80 graus para análise futura. Usando dados do banco de dados de importação disponível publicamente, este gráfico mostra que uma abundância das proteínas LRRK2 e Rab10 é particularmente alta em neutrófilos e monócitos periféricos humanos.
Isolar neutrófilos periféricos com este procedimento resulta em um alto rendimento impuro das células. A tabela na parte superior mostra o número total de células isoladas de 10 mililitros de sangue periférico de três doadores saudáveis. Também são mostradas pureza e viabilidade das células isoladas, bem como rendimento total de proteínas.
Após o tratamento com e sem o inibidor de quinase LRRK2, MLi-2, os neutrófilos são líssedos na presença do potente inibidor de protease, DIFP. Para a figura B do lado esquerdo, 10 microgramas de extratos celulares inteiros por faixa foram submetidos à análise de imunobloto quantitativo multiplex com os anticorpos indicados. A figura à direita, C, demonstra a importância do DIFP para a prevenção da degradação proteolítica, em especial da grande proteína LRRK2.
Em comparação, apenas altas concentrações de PMSF são menos eficazes. Aqui é mostrado que a fosforilação rab10 controlada por LRRK2 é significativamente aumentada em cerca de três vezes em neutrófilos periféricos derivados de pacientes com doença hereditária de Parkinson que abriga uma mutação heterozigous VPS35 D620N quando comparada aos controles. O gráfico superior mostra a análise do imunobloto multiplex e a parte inferior, a quantificação do mesmo.
Isso sugere que a mutação VPS35 D620N ativa o caminho de atividade da quinase LRRK2 por um mecanismo ainda desconhecido. Em resumo, apresentamos um ensaio fácil e robusto para medir a atividade da via de quinase LRRK2 monitorando a fosforilação da proteína rab, como rab10, em neutrófilos derivados do periférico humano, este método nos permite avaliar a atividade da via LRRK2 e determinar como mutações, estados de doença ou inibidores modulam a atividade da via LRRK2.
