Este método ajuda a comparar a atividade citotóxica de diferentes tipos de células usando um método simples e barato que não requer equipamento especializado. A principal vantagem dessa técnica é que ela não requer o uso de materiais perigosos, é barata e não requer o uso de equipamentos especializados. Este método pode ser aplicado para medir a atividade citotóxica de outros tipos celulares, como CD8 mais células citíticas ou mesmo para avaliar a morte espontânea de células sem incubação, sem células efeito citólíticas.
Indivíduos novos nessa técnica provavelmente lutarão com a otimização da relação alvo para efeito ou célula. Meu conselho é fazer uma busca minuciosa na literatura para determinar as proporções que você testaria ao otimizar o protocolo. Embora este método não exija habilidades especializadas, além de pipetar com precisão, o isolamento das células mononucleares e a configuração da placa de ensaio são passos que podem ser mais fáceis de entender e imitar se forem observados visualmente.
Demonstrando o procedimento estará Chelsea Jekelley, uma técnica do meu laboratório. Para iniciar este procedimento, adicione 13,5 mililitros de RPMI em 1,5 mililitros de FBS a uma placa de Petri contendo um filtro de 100 micrômetros. Coloque uma placenta no filtro e use o lado plano de um êmbolo de seringa para empurrá-la através do filtro e para dentro da placa de Petri.
Em seguida, estabeleça três tubos cônicos de 15 mililitros para cada tecido. Adicione três mililitros de gradiente de densidade a cada tubo, e lentamente sobrepõe cinco mililitros de placenta homogeneizada em cada tubo. Centrifugar a 300 vezes G e à temperatura ambiente por 25 minutos sem pausa.
Em seguida, use uma pipeta de transferência para coletar a fina camada branca e buffy. Adicione 10 mililitros de RPMI às camadas polidas combinadas. Centrifugar a 300 vezes G e a 4 graus Celsius por 10 minutos e descartar o supernante.
Primeiro, suspenda a cápsula de célula em 50 microliters de PBS gelado. Adicione anticorpo CD3 com a etiqueta biotina de acordo com o protocolo do fabricante e misture bem com uma pipeta. Coloque o tubo em uma rotadora de tubos e incubar a quatro graus Celsius por 20 minutos.
Em seguida, adicione um mililitro de RPMI. Centrifugar a 400 vezes G e a 4 graus Celsius por 10 minutos. Descarte o supernatante e suspenda a pelota em um mililitro de RPMI.
Combine a suspensão celular com 150 microliters de contas magnéticas em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Transfira o tubo para uma rotadora de tubos e gire enquanto incuba a quatro graus Celsius por 30 minutos. Durante a incubação, recupere o tampão de liberação e deixe-o atingir a temperatura ambiente em um armário de bio segurança.
Depois que a incubação estiver completa, coloque o tubo no ímã por um minuto. Colete o supernatante e salve a população celular negativa de CD3 em um tubo de 15 mililitros no gelo. Remova o tubo do ímã, adicione um mililitro de RPMI e use uma pipeta para misturar as células e as contas cinco vezes.
Em seguida, coloque o tubo de volta no ímã por um minuto. Colete o supernatante e salve a população negativa de CD3 em um tubo de 15 mililitros no gelo. Centrifugar a população negativa de células CD3 a 400 vezes G e a 4 graus Celsius por 10 minutos.
Descarte o supernatante e suspenda a pelota celular em 50 microliters de PBS gelado. Depois disso, adicione anticorpo CD161A rotulado por biotina às células negativas CD3, de acordo com as instruções do fabricante e misture bem. Coloque o tubo em uma rotadora de tubos e incubar a quatro graus Celsius por 20 minutos.
Em seguida, adicione um mililitro de RPMI e centrífuga a 400 vezes G e a quatro graus Celsius por 10 minutos. Descarte o supernatante e suspenda a pelota em um mililitro de RPMI e combine-a com contas magnéticas em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Coloque o tubo na rotadora do tubo e gire enquanto incuba a quatro graus Celsius por 30 minutos.
Em seguida, coloque o tubo no ímã por um minuto. Colete o supernatante e descarte células negativas CD161A negativas do CD3. Retire o tubo do ímã, adicione um mililitro de RPMI e misture bem.
Coloque o tubo no ímã por um minuto, certificando-se de coletar o supernasce e descartar as células negativas CD161A negativas do CD3. Depois disso, remova o tubo do ímã e adicione um mililitro de tampão de liberação de temperatura ambiente. Coloque o tubo em uma rotadora de tubos e gire enquanto incuba por 15 minutos em temperatura ambiente.
Em seguida, coloque o tubo no ímã por um minuto. Colete o supernatante em um novo tubo cônico de 15 mililitros no gelo. Retire o tubo do ímã, adicione um mililitro de RPMI de temperatura ambiente e misture bem.
Coloque o tubo de volta sob o ímã por um minuto, certificando-se de coletar o supernatante no mesmo tubo cônico de 15 mililitros. Misture bem e pegue uma amostra de 20 microliter para contar as células. Centrifugar as células a 400 vezes G e a 4 graus Celsius por 10 minutos.
Remova o supernatante e suspenda as células em RPMI. Semear as células em uma placa de seis poços a uma concentração de 300.000 células por poço em 2,5 mililitros de mídia de ativação celular NK. Incubar a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono em uma incubadora umidificada por 48 horas.
Em um capô, use uma pipeta sorológica para transferir células YAC1 em mídia para um tubo de 50 mililitros no gelo e misture bem. Tome uma alíquota de 20 microliter para contar as células. Gire as células a 300 vezes G e a 4 graus Celsius por 10 minutos.
Usando uma pipeta sorológica, colete o supernasce da célula NK previamente preparada seis placas de poço em tubo cônico de 15 mililitros. Em seguida, adicione trypsin EDTA a cada poço. Toque na placa e coloque-a em uma incubadora a 37 graus Celsius.
Depois que as células tiverem incubado com trippsina EDTA por aproximadamente cinco minutos, use um raspador de placa estéril para raspar a placa. Em seguida, adicione um mililitro de mídia celular NK a cada poço. Usando uma pipeta sorológica, colete as células e mídia e transfira-as para um tubo de centrífuga de 15 mililitros.
Tome uma alíquota de 20 microliter para contar as células. Centrifugar as células NK a 400 vezes G e a 4 graus Celsius por 10 minutos. Primeiro, obtenha um fundo redondo, a cultura tratou 96 bem da placa e configurou-a como descrito na tabela um do protocolo de texto.
Centrifugar a placa de ensaio a 250 vezes G por quatro minutos para ter certeza de que o efeito e as células-alvo estão em contato. Em seguida, incubar a placa em uma câmara umidificada a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por cinco horas. 45 minutos antes da colheita dos supernantes, adicione 10 microliters de solução de lise 10X à célula alvo máxima de LDH e devolva a placa para a câmara umidificada.
Quando a incubação estiver completa, centrifufique a placa a 250 vezes G por quatro minutos e use uma pipetter multicanal para transferir 50 alíquotas de microliter de cada poço para uma placa de ensaio fundo plana de 96 poços. Adicione 50 microliters de reagente de ensaio a cada poço da placa de ensaio. Cubra a placa com papel alumínio para protegê-la da luz e incubar em temperatura ambiente por 30 minutos.
Depois disso, adicione 50 microliters de Stop Solution a cada poço. Certifique-se de ler a placa dentro de uma hora após a adição da Solução stop e gravar a absorvância em 490 nanômetros. As células NK placentárias obtidas de ratos NP e RUPP são incubadas por cinco horas com células-alvo em suas respectivas mídias a uma proporção de 50:1.
Os dados de absorção bruta registrados em 490 nanômetros são mostrados aqui. A absorção média do fundo médio cultural e os poços de controle de correção de volume são calculados, e essas médias são subtraídas dos poços apropriados indicados no protocolo do fabricante. Os valores corrigidos são então utilizados para obter a citotoxicidade utilizando o protocolo fornecido pelo fabricante.
Embora este método não exija habilidades especializadas, além de pipetar com precisão, o isolamento das células mononucleares e a configuração da placa de ensaio são passos que podem ser mais fáceis de entender e imitar se forem observados visualmente. Após o isolamento das células NK, uma série de outros procedimentos poderiam ser realizados, como experimentos de co-cultura para determinar o papel das células NK placentárias na atribuição à migração do trophoblasto durante a gravidez. Também coletamos a mídia das células NK expandidas para avaliar citocinas secretadas das células estimuladas diferencialmente.
A pureza das células isoladas também poderia ser avaliada através da citometria de fluxo.
