Uma aplicação bem sucedida dessas técnicas permitirá a avaliação cinética de ensaios farmacológicos ou a passagem de contaminantes xenobióticos através de uma placenta morfologicamente intacta. A técnica de perfusão da placenta de roedores permite um maior rendimento de estudos farmacológicos ou toxicológicos, uma vez que múltiplos compostos podem ser avaliados usando o tecido de uma única represa. Demonstrando a técnica será Jeanine D'Errico, uma estudante de pós-graduação sênior do meu laboratório.
Antes de iniciar o procedimento, encha suavemente todas as câmaras, agulhas, micropipettos de vidro, tubulação e reservatórios com solução de sal fisiológico aquecido ou PSS, removendo cuidadosamente quaisquer bolhas de ar com uma pipeta de transferência fina, conforme necessário. Vire todas as torneiras de três vias para a posição de fora para fixar o fluido dentro das pipetas. Coloque uma gravata única em cada um dos dois micropipettos de vidro preparados para a canulação uterina e nas duas agulhas de ponta cega designadas para cannulação umbilical.
Em seguida, garanta os laços para evitar perdas durante os movimentos da câmara. Depois de confirmar a falta de resposta ao beliscão do dedo do dedo em um anesthetizado dia gestacional 20 fêmeas grávidas, levante um chifre uterino do abdômen e espalhe o chifre por longos caminho, externo ao animal. Use suturas de seda trançadas para amarrar a artéria uterina nas extremidades vaginal e ovariana do chifre, incluindo o ovário dentro da sutura com o chifre uterino.
Usando tesoura cirúrgica, faça incisões no lado proximal da gravata do ovário e no lado distal da gravata vaginal. Transfira o chifre uterino em um prato dissecado forrado com borracha de silicone e cheio de PSS frio. Com o lado do ovário para a esquerda e o lado vaginal para a direita, empurre suavemente um pino dissecando através do chifre uterino na borracha de silicone para estabilizar o útero.
Selecione uma unidade fetal de placenta materna central ao chifre. Utilizando fórceps finos e tesouras, remova a membrana amniótica da superfície fetal da placenta tomando cuidado para evitar o cordão umbilical. Desvendar e ligar o cordão umbilical para separar o filhote fetal.
Após a identificação da artéria umbilical e da veia, separe suavemente e liga os vasos umbilicais. Em seguida, corte a veia umbilical ligeiramente mais curta que a artéria umbilical para facilitar a identificação. E ligadurar a artéria uterina e veia com tesoura cirúrgica.
Mantendo a orientação correta do fluxo sanguíneo anatômico da artéria uterina, coloque a unidade placentária na câmara de vasos isolada modificada preenchida com PSS oxigenado quente sob um microscópio dissecando. Usando um par de fórceps finos em cada mão, cannulate as extremidades proximal e distal da artéria uterina sobre os micropipettos de vidro. Segure firmemente a artéria com a sutura de nylon estéril previamente colocada.
Cannulate e fixe a artéria umbilical na agulha cega de calibre 23. Em seguida, cannulate e fixar a veia umbilical na agulha cega calibre 25 e enchir todas as torneiras e tubos para evitar bolhas de ar. Lembre-se de verificar todas as torneiras, cânulas e tubos para bolhas de ar, pois um bolus de ar no sistema levará a angústia celular e eliminará o fluxo de corrente do balcão dentro da placenta.
Conecte toda a tubulação de acordo com a figura. Coloque pequenos barcos de pesagem sob a cantaculação distal da artéria uterina materna e sob a cannulação da agulha da veia umbilical fetal para capturar o efluente que surgirá durante o curso do procedimento. Prepare a placa de coleta para o efluente para análise posterior.
Abra a torneira para permitir o fluxo de fluido através da tubulação em direção à placenta e ligue a bomba peristáltica, o controle de pressão e o monitor de pressão. Aumente lentamente a pressão para 80 milímetros de mercúrio lido no monitor de pressão. Abra lentamente a torneira para permitir o fluxo de fluidos para a artéria uterina.
Reabastecer todos os reservatórios para manter o volume do fluido durante todo o experimento. Após os tecidos se equilibrarem por 30 minutos para permitir que a vasculatura se ajuste ao novo fluxo de fluidos, estabeleça a perfusão da linha de base coletando efluentes por 10 minutos de ambos os barcos de pesagem. Meça o volume de fluido que emerge através da artéria uterina e veia umbilical.
Ao final do período de coleta da linha de base, administre o tratamento experimental na artéria uterina. Em seguida, colete amostras da artéria uterina distal e efluente da veia umbilical fetal a cada 10 minutos durante um total de 180 minutos após a infusão. Meça os contaminantes dentro das amostras de fluidos.
A perfusão com corante azul Evans para testar o sistema e visualizar a função de barreira fluida e placentária apropriada para evitar a transferência de contaminantes para o compartimento fetal revela que o corante atingiu e perfundiu o tecido placentário dentro deste sistema. Após uma investigação mais aprofundada, é claro que o corante azul Evans não entrou na veia umbilical fetal, o que é esperado, já que o corante azul evans está ligado à albumina. Neste experimento representativo, foi identificada uma transferência reduzida de fluidos para o compartimento fetal dentro de 10 minutos após a infusão de poliestireno.
A transferência de poliestireno para o compartimento fetal então atingiu o pico de 20 minutos e continuou por 90 minutos. A coisa mais importante a se lembrar durante a cannulação é ir devagar. As pipetas e o tecido são muito delicados e podem facilmente se quebrar ou rasgar.
Ao pesar a efluência, essa metodologia poderia ser usada para investigar a fisiologia placentária, bem como a translocação de materiais.
