O objetivo geral deste procedimento é apresentar uma abordagem experimental otimizada para isolar tecidos embrionários das codornas e embriões de frango. Com esta técnica, obtemos tecidos embrionários puros que podem ser usados em estudos de expressão genética e ensaios funcionais. Tecidos de embriões de codorna e frango são isolados por microcirurgia e sujeitos à digestão enzimática in vitro, preservando suas propriedades biológicas.
Após o isolamento, os tecidos tridimensionais preservados podem ser usados para análise de padrões de expressão genética topográfica de alta resolução. Esta abordagem é particularmente útil para detalhar a expressão genética in situ em territórios embrionários, de outra forma inacessíveis pelos métodos convencionais. Além disso, abordagens de análise de transcriptome também podem ser aplicadas em tecidos isolados sem exigir marcadores genéticos, ao mesmo tempo em que fornecem uma análise omica de alto rendimento específica do tecido.
Alternativamente, os tecidos isolados de ambas as espécies podem ser associados em um ensaio organotipado in vitro por 48 horas. Essa abordagem permite estudar as interações teciduais, uma vez que as células de codorna e frango podem ser discriminadas por características nucleares distintas e marcadores moleculares. A capacidade dos tecidos culturais para formar órgãos pode ser testada ainda mais no ensaio ovo.
Este método é, portanto, uma ferramenta útil para estudar interações complexas teciduais em processos de desenvolvimento com modificações espaçais altamente dinâmicas e também pode ajudar a revelar o potencial de territórios embrionários específicos para a formação de órgãos. Como exemplo, aqui é descrita a formação de timo quimérico de codorna de tecidos embrionários isolados. Primeiro, o endoderme do terceiro e quarto malotes faringeais, o futuro rudimento timímico é isolado da região faringeal de embriões de codorna com três dias de desenvolvimento.
Então, este tecido está associado a um mesenquime capaz de apoiar seu desenvolvimento, o mesoderme somatopleura. Finalmente, a associação heteroespecífica de tecidos é cultivada in vitro e em ovo para formar um timo quimérico. Realizar todos os procedimentos de manipulação de ovos em condições estéreis utilizando uma capa de fluxo laminar horizontal e instrumentos e materiais esterilizados.
Ovos de codorna fertilizados foram incubados com a câmara de ar virada para cima. Para começar, remova os ovos de codorna da incubadora. Prepare uma grande tigela de vidro borossilicato cheia de PBS frio.
Com tesoura curva, bata e corte um orifício circular na casca de um ovo de codorna com três dias de incubação. Faça o orifício no lado oposto da ponta do ovo, e transfira a gema para a tigela com PBS frio. Remova o embrião da gema cortando a membrana vitelline externamente para vasos extraembrínicos.
Com a ajuda de fórceps finos, transfira o embrião para uma pequena tigela cheia de PBS frio, em seguida, mova o embrião para uma placa de Petri com base preta com um skimmer. Remova a região farínngeal contendo o terceiro e quarto malotes faringeais, conforme descrito na ligadura anterior do Jove SPA. Em seguida, transfira a terceira e quarta região do arco faringeal para um copo que é preenchido com pancreatina fria e incubar por uma hora, no gelo, para digestão enzimática.
Note-se que o período de incubação da digestão enzimática depende do estágio de desenvolvimento. Coloque a folha de vidro sob o microscópio estéreo e isole o endoderm da terceira e quarta região do arco faringeal, usando dois micro-bisturi em um suporte. Primeiro coloque a região faringeal com o lado dorsal para cima, mostrando internamente o endoderm e o ectoderm na superfície externa.
Observe o ectoderme, o endóderme, o mesenquime, o tubo cardíaco e a porção ventral do tubo neural. Remova o tubo neural e o mesoderme ligado à superfície dorsal do endoderme faringar. Observe o endoderme da faringe, a quarta e terceira bolsas faringeais, e o tubo cardíaco.
Com o lado dorsal para cima, desprende cuidadosamente e remova o mesenquime entre os arcos faringes e exponha as bolsas faringeais. Realize este procedimento do outro lado da região faringeal. Remova o mesenquime preso à parte mais posterior do endoderme e observe a quarta bolsa faringeal.
Com lado posterior para cima, observe bolsas de faringeal esquerda e direita. Continue removendo o mesenquime anexado à parte mais posterior do endoderme e à segunda bolsa. Remova o tubo cardíaco e o mesenquime ao redor das bolsas interiores.
Com o lado ventral para cima, observe o endoderme da faringe e o lado direito do arco faringeal secundário. Nesta fase, o endoderme do rudimento da tireoide deve ser visível. Retire o ectoderme do segundo e terceiro arcos faringeais e remova cuidadosamente o mesenquime dos arcos.
Observe a remoção do mesenquime do segundo arco faringeal do lado direito. Observe a localização do quarto e terceiro malotes e rudimento da tireoide. Remova os restos para células mesenquimais presas às bolsas faringeais.
Observe o terceiro e quarto malotes do lado direito e a quarta bolsa do lado esquerdo. Repita o desprendimento mesenquime do lado esquerdo. Observe agora a terceira bolsa do lado esquerdo.
Observe o desprendimento mesenquime do segundo arco do lado esquerdo. Observe que todas as superfícies e soluções devem ser mantidas frias durante este procedimento. Mude para uma nova solução de pancreatina fria e prato em caso de demorar muito tempo para dissecar os tecidos.
Por fim, faça um corte transversal entre o segundo e o terceiro faringeal bolsas para remover os segundo malotes e o rudimento da tireoide. Neste ponto, o endoderme isolado é composto pela terceira e quarta bolsas faringeais e a ponta posterior da faringe. Remova os restos de mesenquime separados com a ajuda de dois micro-bisturis.
Transfira o endódermo isolado para um prato de vidro cheio de soro bovino fetal frio e mantenha-o no gelo durante a preparação do ensaio in vitro. Os ovos foram colocados na posição horizontal e o lado superior marcado para o uso de carvão. Para começar, remova os ovos da incubadora.
Com uma tesoura curvada, abra um pequeno buraco na casca, insira uma agulha e aspire dois mililitros de albumina com uma seringa de 10 mililitros. Abra um orifício circular na região marcada da concha e corte a membrana vitelline externamente para os vasos embrionários extras enquanto segura o embrião com fórceps finos. Sob um microscópio estéreo, coloque o embrião em uma placa de Petri com base preta contendo PBS frio.
Use quatro pinos de inseto para segurar o embrião no fundo da placa. Coloque os pinos na região extraembryônica formando uma forma quadrada. Realize dois cortes entre as somitas 19 e 24 transversalmente até o eixo do embrião e cruzando o embrião.
Solte esta seção cortando as bordas embrionárias marginais. Observe a placa lateral, tubo neural e somitas. Aspire e transfira os tecidos para um prato de vidro cheio de pancreatina fria.
Incubar por 30 minutos no gelo para digestão enzimática. Sob o microscópio estéreo, isole o mesoderm dos tecidos circundantes usando dois micro-bisturis em suportes. Observe o mesoderme somatopleura, o splanchnopleura, o tubo neural e o ectoderme.
Primeiro, remova o ectoderm na superfície. Observe o mesoderm somatopleura dissociado do ectoderm. Em seguida, desprender cuidadosamente o splanchnopleura localizado de forma periculosa da somatopleura.
Observe o mesoderm lateral direito da somatopleura. Solte-o cortando-o em um movimento paralelo ao tubo neural. Observe que todas as superfícies e soluções devem ser mantidas frias durante este procedimento.
Mude para uma nova solução de pancreatina fria e prato em caso de demorar muito tempo para dissecar os tecidos. Observe o mesoderme lateral esquerdo da somatopleura, somitas, tubo neural e ectoderme. Repita a liberação de mesoderm deste lado.
Faça movimentos lentos com o micro-bisturi. As proteínas da matriz extracelular expostas se sentam através de tecidos e instrumentos, impedindo os movimentos dos fluidos. Corte cuidadosamente a somatopleura em um movimento paralelo ao tubo neural.
Transfira o mesoderm isolado para um prato de vidro cheio de soro bovino fetal frio e mantenha-o no gelo durante a preparação do ensaio in vitro. Coloque uma grade de metal em malha fina em uma placa de Petri e preencha com meio de cultura. Remova os líquidos excessivos para nivelar a superfície média com a parte superior da grade.
Com a ajuda de fórceps finos, mergulhe um filtro de membrana no meio da cultura e coloque-o cuidadosamente na parte superior da grade para ter uma superfície em contato com ela. Sob o microscópio estéreo, transfira o endoderm isolado da folha de vidro para o filtro de membrana deslizando suavemente com a ajuda de espátula e fórceps finos. Repita este procedimento para o mesoderm isolado.
Com a ajuda de um micro-bisturi, misture os tecidos para maximizar sua associação. Coloque cuidadosamente os tecidos associados em uma incubadora umidificada a 37 graus com 5% de CO2 durante 48 horas. Após o período de incubação, enxergá-los os tecidos de cultura na membrana do tipo coriolan e permitem que ele se desenvolva em oval por mais 10 dias para completar a formação de órgãos como descrito anteriormente.
Aqui está o método reticular que permite que o isolamento de tecidos embrionários aviários seja usado em abordagens experimentais distintas. Como exemplo, a expressão de genes conhecidos por estarem envolvidos na formação das bolsas faringeais também foi avaliada como um endodermo isolado contendo a segunda, terceira e quarta bolsas faringeais dos embriões de frango no terceiro dia e meio por montagem inteira na hibridização in situ. A expressão de Sonic Hedgehog foi detectada no endoderme da faringe central e excluída das bolsas, enquanto bmp7 foi expresso no endoderme do segundo e terceiro faringeal bolsas e excluído da faringex central e quarta bolsa faringeal.
Tecidos isolados também podem ser in vitro especificamente associados in vitro por 48 horas, enxerto na membrana tipo coriolan, e permitido desenvolver-se por mais 10 dias. Explantas podem ser analisadas por histologia convencional e imunohistoquímica. Alguns resultados representativos da associação do endoderme de codornas a partir do terceiro e quarto malotes faringeais com mesoderme somatopleura de frango são os seguintes -Enxertos mostraram um timo quimérico totalmente formado com células epiteliais timitárias derivadas de codorna positivas para qcpn e células linfoides de frango.
Além disso, o epitélio timiológico positivo de citokeratina mostrou características morfológicas normais, exibindo uma arquitetura reticular típica. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento de como isolar os tecidos embrionários de codorna e frango que podem ser usados em estudos de expressão genética e formando órgãos quiméricos também podem ajudar a decifrar a complexidade da genética dos órgãos.
