O trabalho foi suportado por concessões do Helse og Rehabilitering (JLB), The Norwegian Research Council (GH e JCG) e da Universidade de Oslo (NK e JCG).

1. Isolamento e cultura de células estaminais humanas e preparação para injeção em embriões <ol><li> Células-tronco humanas utilizadas como exemplos neste protocolo (cérebro, medula óssea, tecido adiposo), são isolados de diferentes maneiras a partir de tecidos diferentes. Por exemplo, células-tronco adultas neurais são isolados a partir de pedaços de tecidos coletados a partir da parede do ventrículo do cérebro durante a neurocirurgia endoscópica, que são então dissociados para as células individuais que são cultivadas in vitro. As células-tronco neurais formam espontaneamente neurospheres que flutuam no meio de cultura, enquanto outros tipos de células aderem ao fundo do prato 7. Derivadas de tecido adiposo células-tronco mesenquimais são obtidos a partir lipoaspiração material que é enzimaticamente digerido e tensas para remover o tecido fibroso e, em seguida, centrifugado para remover adipócitos maduros. As células resultantes são ressuspenso em meio de cultura suplementado com soro para promover a proliferação de células-tronco em outros tipos de células-tronco hematopoéticas e 8 células progenitoras pode ser isolada de aspirados de medula óssea por seleção positiva usando anticorpos específicos conjugados a partículas magnéticas (Myltenyi Biotec, Alemanha ou Dynal-Invitrogen, EUA) e separação de células magnéticas e / ou através de anticorpos conjugados com fluoróforos e separação de células ativadas por fluorescência (FACS) 9. </li><li> Para facilitar a posterior identificação, rótulo as células-tronco com um marcador fluorescente antes da implantação em embriões de galinha. Células-tronco podem ser rotulados com corantes fluorescentes lipofílicos, como DII (Invitrogen, EUA) ou PKH26 (Sigma, EUA), utilizando-fornecedor recomendado protocolos até pouco antes da implantação, ou, por uma etiqueta permanente com essencialmente nenhum perigo de contaminar células hospedeiras, eles podem ser transduzidas com o gene de uma proteína fluorescente, como proteína verde fluorescente, usando lentivirais, ainda em cultura 10. </li><li> Protocolos para a cultura e propagação de células estaminais humanas variar. Protocolos detalhada pode ser encontrada na literatura. Resumidamente, as células-tronco formadoras de esfera são normalmente cultivadas em frascos, enquanto as células-tronco aderentes são normalmente cultivadas em placas de Petri (que facilitam a trituração quando a divisão, veja abaixo), em meio apropriado. Para a divisão ou a colheita, pellet esfera células formadoras de centrifugação por 5 min a 1200rpm e ressuspender em pré-aquecido solução de tripsina / EDTA por não mais de 5 min a 37 graus Celsius. Para células aderentes adicionar a solução de tripsina / EDTA para a placa de Petri, e triturar no final de 5 minutos. Rescindir o tripsinização adicionando Ca 2 + meio contendo, às vezes complementada com a albumina. Para remover a tripsina / EDTA, centrifugar as células (5 min a 1200rpm), remover o sobrenadante, ressuspender em veículos de injeção fria (tipicamente médio ou tampão fosfato), e centrifugar novamente (5 minutos a 1200rpm). Remover a maior parte deste sobrenadante e ressuspender delicadamente as células para criar uma suspensão de células altamente concentrado. </li><li> Manter a suspensão de células estaminais humanas em um frasco pequeno, tampado ou tubo de microcentrífuga em gelo por várias horas antes da injeção. Sobrevivência no estado pode ser dependente do tipo de célula. O veículo de injecção deve ser otimizada de acordo com as propriedades das células, incluindo a sua adesividade (por exemplo, um baixo-Ca 2 + veículo pode ajudar a prevenir a aglutinação) e resistência a mudanças hipóxia e pH. </li></ol> 2. Incubação dos ovos e preparação <ol><li> Armazenar ovos fertilizados em uma câmara de resfriamento (por exemplo: Termaks, Bergen, Noruega) a 14-15 ° C antes da incubação. Neste desenvolvimento de temperatura de incubação é preso até que se inicia. Ovos fertilizados armazenados por mais de 10 dias ou em temperaturas mais baixas têm uma menor taxa de subseqüente desenvolvimento e sobrevivência. </li><li> Para reiniciar o desenvolvimento, coloque os ovos em um umidificado, forçado projecto incubadora (por exemplo: Binder, New York, EUA) em 38-39 ° C, e incubar até o estágio de desenvolvimento desejado seja alcançado (para o estadiamento, ver ref 11. ). </li><li> Antes de abrir o ovo, criar um bolsão de ar acima do embrião através da inserção de uma agulha 18 gauge seringa através da casca do ovo (não muito profundamente para evitar perfurar a gema) e evacuar 4 ml de albumina (Figura A). Isso cria uma queda de pressão que, dentro de alguns minutos é equalizada com a entrada de ar através da casca porosa. Como o ar entra ele coleta no ponto mais alto dentro da casca, separando assim o embrião da superfície interna da casca. </li><li> Sele o orifício criado pela agulha da seringa com fita plástica convencional. </li></ol> 3. Puxando micropipetas de vidro <ol><li> Puxe micropipetas de vidro de vidro de borosilicato (por exemplo, 1,2 milímetros OD x 0,94 mm de diâmetro, Harvard Apparatus, EUA) em um extrator eletrodo convencional (por exemplo, modelo P-2000, Sutter Instruments, EUA). Ajustar as configurações do extrator para obter micropipetas que têm resistência de entrada elevada quando usado como microelectrodes. Dicas deve ser de aproximadamente 1-1,5 cm de comprimento. Os eixos podem ser marcadas em intervalos de 1 mm para calcular volumes ejetados. </li><li> Quebrar a micropipeta dicas para uma dimensão funcional, dobrando-as com uma pinça ou empurrá-los contra uma superfície sólida durante a visualização ao microscópio. A quebra deve ser o mais uniforme possível em todo o perímetro do vidro e do diâmetro resultante interior na ponta deve acomodar o tamanho das células para serem usadas sem ficar obstruídos. Normalmente, um mícron de diâmetro 20-30 interior funciona bem. </li></ol> 4. Preparação da solução corante Fast Green (reagente contrastantes) <ol><li> Preparar uma solução 0,1% (w / v) de Fast Green corante (Sigma-Aldrich, EUA) pela dissolução em solução salina fisiológica de frango (137 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 1 mM Na- fosfato, 5 mM HEPES, 11 mM glicose, pH 7,4). </li><li> Filtrar a solução através de um Fast Green 0,22 mM Millex GP filtro (Millipore Co., Bedford, EUA). </li></ol> 5. Abrindo os ovos e contrastando o embrião <ol><li> Coloque dois pedaços de fita adesiva na parte superior do ovo, cobrindo as dimensões do bolsão de ar. Mantendo o ovo orientada para que a área gravada (e, portanto, a bolsa de ar) é mais alta, corte uma pequena janela dentro das fronteiras da área gravada usando uma tesoura de dissecção resistente. A fita adiciona suporte e ajuda a prevenir fragmentos de casca de ovo de cair sobre o embrião. Bolhas de ar associada à bolsa de ar pode ser estalado usando o back-end de uma ponteira de plástico ou sonda blunt outros. </li><li> Desenhar uma solução Fast Green em uma seringa de 1 ml com uma agulha de calibre 25. Remover quaisquer bolhas de ar na seringa e da agulha. Dobrar a agulha a um ângulo de 45 graus, penetrar em um ponto fora da placa embrionária (identificado pelo anel de vasos sanguíneos que circunscrevê-la; perfuração dentro do embrionárias mortalidade aumenta placa) e guiar cuidadosamente o needlepoint sob o embrião. Injetar o corante até que o contraste desejado seja alcançado. O embrião, que é normalmente transparente, agora deve se destacar como um fantasma esbranquiçada contra a cor verde escuro (Figura B). Muitos investigadores usam Índia Ink (diluído a 10% v / v) em vez de verde Fast. Neste caso, é importante o uso de tinta que a Índia não é tóxico, como tinta Pelikan India Fonte. </li></ol> 6. Fazendo rombencéfalo e lesões da medula espinhal do tubo neural <ol><li> Produzir agulhas de tungstênio afiadas por chama-ataque de curta duração (2-3 cm) peças de 100 haste de tungstênio M diâmetro (número de catálogo 719000, A &amp; R Systems, Seattle, Washington), com uma tocha de acetileno / oxigênio. Isso é feito inserindo a ponta da vara muito brevemente na chama da tocha até que uma faísca é visto, o que representa a erosão explosiva das camadas exteriores de tungstênio, deixando para trás uma ponta afiada. </li><li> Usando uma agulha afiada de tungstênio fatia, através de e desviar a membrana vitelina que cobre a área de microcirurgia. </li><li> Usando uma agulha de tungstênio segundo afiada (a ponta da agulha primeira é frequentemente danificada após o corte através da membrana vitelina e não apto para microcirurgia subseqüente), corte com cuidado através do epitélio do tubo neural e desviá-lo, em seguida, corte em torno e sob a peça do tubo neural a ser removido, utilizando-se curtos, rápidos movimentos ascendentes (Figura C). Fazer os cortes transversais em primeiro lugar e, em seguida, os cortes longitudinal é geralmente mais bem sucedidos. Não corte muito profundo sob o risco de penetrar vasos sanguíneos subjacentes, que normalmente é fatal. </li><li> Suavemente flip ou arrastar a peça de tecido ressecado longe do local da lesão utilizando a agulha de tungstênio. Se isso for difícil, ele também pode ser retirado por sucção da boca usando uma micropipeta de vidro ligado a tubos flexíveis. </li></ol> 7. Injeção de células-tronco humanas a. Injeção em uma lesão do tubo neural Desenhe uma pequena quantidade de células para a ponta de uma micropipeta de vidro por sucção da boca usando um tubo de plástico. A concentração de trabalho da suspensão de células deve ser otimizado para o tipo de célula a ser injetado. Monte a micropipeta em um micromanipulador e conectá-lo a uma bomba de microinjetor (por exemplo: PV830 PicoPump Pneumático, WPI, Washington, EUA). Sob controle visual usando um microscópio de dissecação, guia a ponta micropipeta na lesão e cuidadosamente expelir as células, aumentando a pressão do ar (ou por pulsos de pressão constante ou por gradualmente aumentando a pressão) (Figura C). Quando a quantidade desejada de células é depositada no local da lesão, cuidadosamente retirar a micropipeta. b. Injeção para o lúmen do tubo neural Em alguns casos pode ser desejável para injetar células nos ventrículos do cérebro em desenvolvimento, por exemplo, se as células são invasivos suficiente para ter acesso ao tecido neural, na ausência de lesões. Injeção de células para o lúmen de qualquer brain região requer o uso de um estágio de desenvolvimento em que a luz proporciona um recipiente grande o suficiente e é de fácil acesso; estágios HH 12-18 são favoráveis ​​a este respeito. A lesão não é necessário. Basta furar a parede do tubo neural com a micropipeta de vidro antes da injeção das células. Os elementos-chave para o sucesso deste método são a nitidez da micropipeta e ao carácter abrupto da penetração; muito lento e um movimento na ponta micropipeta só pode dimple a parede do tubo neural sem penetrar. c. Injeção sistêmica Injeções sistêmicas podem ser feitas através dos vasos extra-embrionárias do sangue (a partir de HH estágio 15, quando esses navios são bem desenvolvidos). Isso não é raro acompanhada por algum sangramento e, desde há muitas pequenas artérias e veias menos maiores, intra-arterial injeções são geralmente mais seguros quando se trata de sobrevivência do embrião. Por outro lado, injeções intravenosas fornecer um acesso mais rápido das células do coração e, assim, provavelmente, uma distribuição mais uniforme das células. A injeção de sucesso requer uma micropipeta afiada com um diâmetro menor do que o navio-alvo. Abordagem da embarcação ao longo de seu eixo em um ângulo pequeno em relação à horizontal (cerca de 30 graus). Empurre a micropipeta contra o navio até o navio começa a oclusão. Em seguida, empurre ainda mais em uma empresa de movimento abrupto de penetrar. Retrair lentamente até que o sangue é visto como desenhar por ação capilar para a ponta da micropipeta. Injeção de células deve então ser realizada utilizando a pressão constante, após o qual a micropipeta é recolhido com um movimento rápido. 8. Vedação do ovo <ol><li> Após a injeção, deixe o ovo ficar parado por alguns minutos para permitir que as células injetadas para se estabelecer e aderir. Para evitar a desidratação (que pode ocorrer rapidamente e pode ser fatal), coloque um pedaço de tecido umedecido ou filtro de papel sobre a janela durante este período de descanso. </li><li> Depois de alguns minutos e as células se instalaram, seca a casca ao redor da janela e feche a janela com fita plástica convencional. Certifique-se que este selo está apertado e que nenhum de albumina pode vazar através da abertura ou entre o reservatório ea fita (essa prova frequentemente fatal durante a incubação subsequentes). </li><li> Substituir os ovos para a incubadora forçada projecto de desenvolvimento. Observação pode ser feita em intervalos removendo a fita sobre a janela. </li></ol> 9. Dissecção embrião <ol><li> Uma vez que o embrião tenha alcançado o estágio desejado, crack abrir o ovo em uma tigela de gelado soro fisiológico ou tampão fosfato (a fita que cobre a janela deve ser cortada primeiro a permitir que as duas metades da casca do ovo para separar). O soro fisiológico gelado serve para anestesiar o embrião por hipotermia. O coração deve lenta e rapidamente parar dentro de um par de minutos. </li><li> Separar o embrião das membranas extra-embrionário e fase, usando ref. 11. </li><li> Decapitar o embrião, transferi-lo para um prato de dissecção que tem um piso de borracha de silicone e contém oxigenados soro fisiológico suplementado com glicose (137 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 1 mM Na-fosfato, 5 HEPES mM, 11 mM glicose, pH 7,4) e pin-lo lado ventral para cima rápido. Retire as vísceras abdominais e torácicas. Usando uma tesoura em ângulo, fazer incisões longitudinal ao longo de cada aspecto ventrolateral da coluna vertebral. Particularmente em fases posteriores (após o dia 6 de desenvolvimento), a incisão inicial de melhor se faz na região lombo-sacra, onde o espaço entre as vértebras ea medula espinhal é maior. Remover a face ventral da coluna vertebral para revelar a medula espinhal. Certifique-se que o soro fisiológico permanece oxigenado por borbulhamento em cerca de 10 minutos com oxigênio medicinal puro. </li><li> Corte cuidadosamente as raízes nascente dorsal e ventral de cada lado, transecto da medula espinhal nos níveis desejados, e gentilmente levantá-lo para fora do canal vertebral. A medula espinhal vai sobreviver por muitas horas nesse estado e pode ser submetido a 12 anatômicas e fisiológicas 13,14 experimentos. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2071/2071fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. A) A abordagem adequada para a evacuação de albumina. Observe a posição do embrião e da colocação da agulha. B) Em contraste do embrião. Observe o ponto de penetração da agulha fora do disco embrionário. C) Representação esquemática do procedimento para a lesão do tubo neural unilateral espinhal seguido de transplante de células.

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Não há conflitos de interesse declarados.

O embrião de galinha é um modelo animal prático e versátil para experimentos xenotransplante. A falta de um sistema imune funcional durante o desenvolvimento embrionário e fetal permite a sobrevivência eo desenvolvimento de células de qualquer espécie que tolera a temperatura de incubação. Embriões de galinha têm sido usados ​​para testar o potencial regenerativo de vários tipos de células-tronco (revisado na ref. 15). Células-tronco de mamíferos pode integrar em tecidos de frango embrião, incluindo o sistema nervoso central, onde podem dar origem a neurônios cujos axônios projeções, conectividade sináptica e propriedades eletrofisiológicas pode ser avaliada no contexto de 1,2 funcional circuitos neurais. Porque os procedimentos cirúrgicos são relativamente fáceis, e as injeções são feitas com visuais em vez de controle estereotáxico, o número de embriões pode ser facilmente aumentado para acomodar diferentes condições experimentais dentro de um único experimento. Normalmente as células podem ser injetadas em embriões de 2-30 dentro de um experimento de 4 horas. A mortalidade pós-injeção dos embriões é o principal fator limitante. Devem ser tomadas precauções para evitar a hemorragia e desidratação. Estar ciente de que há certos críticos estágios de desenvolvimento em que os aumentos da taxa de mortalidade naturais. Completa o embrião com alguns mililitros de injeção quente campainha, esterilizados frango seguinte e no dia anterior decisivas fases de desenvolvimento, bem como assegurar que a janela em que o ovo é bem fechados e orientada para evitar vazamento, melhora a sobrevivência. Se o vazamento através do selo de fita deve ocorrer, remova a fita, seque as superfícies e re-fita. Alguns investigadores usam cera e de vidro ou de plástico lamelas para selar a janela. A mortalidade não deve ser substancialmente diferentes em injetada contra sham-operado embriões. Embora tenhamos focado aqui na injeção de células-tronco humanas no primórdio do cérebro e da medula espinhal, as células-tronco também podem ser injetados no primórdio de outros órgãos (ver, por exemplo ref. 4). Cada órgão apresenta seus próprios desafios. Por exemplo, a injeção para o coração pode ser um desafio por causa da alta resistência mecânica à penetração da pipeta e por causa de movimentos, que, por outro lado pode ser retardado por resfriamento dos embriões a temperatura ambiente antes da injeção. Órgãos que não possuem uma luz pode não acomodar a injeção de volumes suficientes e podem, portanto, necessitam de lesão cirúrgica para criar um receptáculo. Em nossa experiência, pós-lesão regeneração de tecidos é uma vantagem, pois promove a integração das células-tronco humanas para o tecido. Células também pode ser injetado em mesênquima embrionário, como o mesênquima dispersar somítica ou da crista neural migram como uma maneira de conseguir incorporação derivados mesenquimais, incluindo os gânglios derivadas da crista neural periférica 16,17.

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<td>Mice</td>
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<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
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<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Slidebook</td>
<td>Program</td>
<td>Olympus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
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xenotransplantation of human stem cells into the chicken embryo

O embrião de galinha é um modelo animal clássica para estudar o desenvolvimento embrionário e fetal normal e para xenotransplante experimentos para estudar o comportamento de células em um padrão<em&gt; In vivo</em&gt; Ambiente. As principais vantagens do embrião da galinha são de baixo custo, alta acessibilidade, facilidade de manipulação cirúrgica e à falta de um sistema imunológico totalmente desenvolvido. Xenotransplante em embriões de galinha pode fornecer informações valiosas sobre a proliferação celular, diferenciação e comportamento, as respostas das células aos sinais em nichos definidos tecido embrionário e potencial carcinogénico. Transplante de células em embriões de galinha também pode ser um passo para experimentos de transplante em outros modelos animais. Recentemente, o embrião de galinha tem sido usado para avaliar o potencial de neurogênica estaminais humanas e células progenitoras após a implantação em anlage neural<sup&gt; 06/01</sup&gt;. Neste vídeo podemos documento todo o processo de transplante de células-tronco humanas para o desenvolvimento do sistema nervoso central do embrião de galinha. O procedimento começa com a incubação de ovos fertilizados até embriões da idade desejada desenvolveram. A casca é então aberta, eo embrião contrasta com a injeção de tinta entre o embrião ea gema. Pequenas lesões são feitas no tubo neural utilizando microcirurgia, a criação de um site de regeneração para a deposição de célula que promove a integração posterior no tecido hospedeiro. Demonstramos injeções de células-tronco humanas em tais lesões feita na parte do tubo neural que forma o rombencéfalo ea medula espinhal, e para a luz da parte do tubo neural que forma o cérebro. Injeções sistêmicas nas veias e artérias extra-embrionário também são demonstradas como alternativa para fornecer células para os tecidos vascularizados, incluindo o sistema nervoso central. Finalmente vamos mostrar como remover o embrião do ovo após vários dias de desenvolvimento e como dissecar a medula espinhal livre para posteriores análises fisiológicas, histológicas ou bioquímicas.

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Xenotransplantation of Human Stem Cells into the Chicken Embryo

Neste artigo apresentamos um método de transplante de células-tronco humanas em várias regiões do sistema nervoso central do embrião de galinha. Isto proporciona uma<em&gt; In vivo</em&gt; Modelo de avaliação da proliferação e diferenciação dos vários tipos de células-tronco humanas em ambientes tecido embrionário.

Xenotransplante de células-tronco humanas no embrião de galinha

The chicken embryo is a classical animal model for studying normal embryonic and fetal development and for xenotransplantation experiments to study the ...

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Research

JoVE Journal

Biology

19.2K visualizações.  University of Oslo. Neste artigo apresentamos um método de transplante de células-tronco humanas em várias regiões do sistema nervoso central do embrião de galinha. Isto proporciona uma In vivo Modelo de avaliação da proliferação e diferenciação dos vários tipos de células-tronco humanas em ambientes tecido embrionário.

Vídeo: Xenotransplantation of Human Stem Cells into the Chicken Embryo

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

Yeah, so I'm Lauren Deon. I'm in charge of the Human Amgen stem cell co facility at MGH. Yeah, so I'm Lauren, I'm in charge of the Human AM stem cell co facility at MGH.So I've been working with human Amgen stem cells for years now since I was a postdoc in George De Lab before, from four, four years. And so right now we have two cell lines, H one and H nine, which are both from Y cell. And so the way we are expanding or maintaining these cells in culture is by, at least the way we are splitting these cells is by using collagenous.So what I usually do is for the first few passage after throwing the cells, I use a technical, the picking colonies. So in this case, I can check under the microscope which colonies are good and differentiate and nice shape, and I will collect only these colonies and I will cut them in few pieces and put them back in, in a fresh flat. And the, the colonies that look kind of differentiate it are just left them alone.The other way to pass the cells is by using trypsin. So I don't use this technique here. I think collagenase is a little bit safer because human being stem cells don't like to be individualized or they don't like to be alone.So if you do trypsin, if you use trypsin for a little bit too long, if you use it for like three to four minutes, which is the way we use strips in for other type of cells, human stem cells will be individualized and most of them will die or just differentiate or will not attach to the myth. So the idea is you have to keep the cells as clumps. You don't want them to be alone in the in, in the flask.So using collagenase, the advantage is to keep cells as plants. Using chipsy, you just select for cells that will survive this very, very harsh process of g opsonization. So these cells are usually very highly proliferative.So you get, you can adapt your cells to this tripsin process. The problem is that you have cells that they behave differently, they go much faster. And one risk is that you can get some commercial abnormality to, to this, to this very high division process.So you say that ization can cause selection of cells in culture for most proliferative cells.Right. More ative and probably also higher survival rates than other cells. So after proliferation, basically culture after proliferation in tripsin, after several passages become a different culture, these different properties.So it's, it's hard to figure out if they are exactly identical. If you do the test, the usual test, let's say you check markers, regular markers of end differentiated cells like OC four, nano one 60 SC four C, C3, all this molecule might still be expressed. If you do TER formation, this cells might still differentiate and be formed like al like normal cells.If you look at the karyotype, you might have some abnormality, but you might still have a normal karyotype. The, the, the selective advantage might be due to just a mutation that you cannot see by doing a karyotype. So the fact that they grow much faster is by itself I think a little bit worser.And if we want to use these cells for transplantation at some point, I would definitely not use this type of cells.Okay. So would you like to tell me what are the main technical problems with using this technique for, for passages of cells? So using S, yes.It's just a little bit longer and also it's, since the cells are not going as fast, it's just much longer to get a high number of cells to do some experiment. So it's just less convenient I would say. Would you like to tell me about few words about the goals of your experiment?How do you use CS cells? Okay, so my main project here is to get endothelial cells from human AB stem cells. And the idea is to be able to make blood.And we are working a lot with tissue bioengineering labs and one of their goal is to make tissue in vitro. But one of the limitation to this is the lack of blood vessels going through this tissues. So if we can bring endothelial cells or put endothelial cells in this tissue, we would have better growth of this tissue.So the idea few sources of cells are known for endothelial cells like cold blood or pressure blood, but it would be interesting to have another source of cells like human years. And the advantage is since human years can be expanded and most infinitely, you could modify these cells, make some inducible system and be able to use it. Then in your final product, your material cells, in this case.

Propagação de-tronco embrionárias humanas (ES) Células

Biologia

Transfecting Human Neural Stem Cells with the Amaxa Nucleofector

Transfection of primary mammalian neural cells, such as human neural stem/precursor cells (hNSPCs), with commonly used cationic lipid transfection reagents has often resulted in poor cell viability and low transfection efficiency.  Other mechanical methods of introducing a gene of interest, such as a &#8220;gene gun&#8221; or microinjection, are also limited by poor cell viability and low numbers of transfected cells.  The strategy of using viral constructs to introduce an exogenous gene into primary cells has been constrained by both the amount of time and labor required to create viral vectors and potential safety concerns.  We describe here a step-by-step protocol for transfecting hNSPCs using Amaxa's Nucleofector device and technology with electrical current parameters and buffer solutions specifically optimized for transfecting neural stem cells.  Using this protocol, we have achieved initial transfection efficiencies of ~35% and ~70% after stable transfection.  The protocol entails combining a high number of hNSPCs with the DNA to be transfected in the appropriate buffer followed by electroporation with the Nucleofector device.

Introducing a gene of interest into a cell is a powerful method for elucidating its function in vivo. This protocol describes an efficient method of transfecting a culture of human neural stem/precursor cells (hNSPCs) using the Nucleofector electroporation apparatus made by Amaxa.

Transfecting células-tronco neurais com o Nucleofector Amaxa

Transfection of primary mammalian neural cells, such as human neural stem/precursor cells (hNSPCs), with commonly used cationic lipid transfection ...

Counting Human Neural Stem Cells

Knowledge of the exact number of viable cells in a given volume of a cell suspension is required for many routine tissue culture manipulations, such as plating cells for immunocytochemistry or for cell transfections. This protocol describes a straightforward and fast method for differentiating between live and dead cells and quantifying the cell concentration and total cell number using a hemacytometer. This procedure first requires detaching cells from a growth surface and resuspending them in media. Next, the cells are diluted in a solution of Trypan blue (ideally to a concentration that will give 20-50 cells per quadrant) and placed in the hemacytometer. Finally, averaging the counts of viable cells in several randomly selected quadrants, dividing the average by the volume of one 1 mm2 quadrant (0.1 &mu;l) and multiplying by the dilution factor gives the number of cells per l. Multiplying this cell concentration by the total volume in &mu;l gives the total cell number. This protocol describes counting human neural stem/precursor cells (hNSPCs), but can also be used for many other cell types.

Knowledge of the exact number of viable cells is required for many tissue culture manipulations. This protocol describes how to differentiate between live and dead cells and quantify cells using a hemacytometer. Although it describes counting human neural stem/precursor cells (hNSPCs), it can be used for other cell types.

Contando células-tronco neurais

Knowledge of the exact number of viable cells in a given volume of a cell suspension is required for many routine tissue culture manipulations, such as ...

Passaging Human Neural Stem Cells

The ability to manipulate human neural stem/precursor cells (hNSPCs) in vitro provides a means to investigate their utility as cell transplants for therapeutic purposes as well as to explore many fundamental processes of human neural development and pathology.  This protocol presents a simple method of culturing and passaging hNSPCs in hopes of standardizing this technique and increasing reproducibility of human stem cell research.  The hNSPCs we use were isolated from cadaveric postnatal brain cortices by the National Human Neural Stem Cell Resource and grown as adherent cultures on flasks coated with fibronectin (Palmer et al., 2001; Schwartz et al., 2003).  We culture our hNSPCs in a DMEM:F12 serum-free media supplemented with EGF, FGF, and PDGF and passage them 1:2 approximately every seven days.  Using these conditions, the majority of the cells in the culture maintain a bipolar morphology and express markers of undifferentiated neural stem cells (such as nestin and sox2).

The ability to manipulate human neural stem/precursor cells (hNSPCs) in vitro allows to investigate their utility as cell transplants for therapeutic purposes and to explore human neural development. This protocol presents a method of culturing and passaging hNSPCs in hopes of increasing reproducibility of human stem cell research.

Passaging células-tronco neurais

The ability to manipulate human neural stem/precursor cells (hNSPCs) in vitro provides a means to investigate their utility as cell transplants for ...

Immunocytochemistry: Human Neural Stem Cells

Immunocytochemistry is a very powerful and fairly straightforward method for determining the presence, subcellular localization, and relative abundance of an antigen of interest, most commonly a protein, in cultured cells. This protocol presents an easy-to-follow series of steps that will enable researchers to conserve primary and secondary antibodies while getting high quality, reproducible qualitative and quantitative data out of their staining. There are two aspects of this protocol that help to conserve the volume of antibody necessary for staining. For one, the cells are grown on small, circular coverslips that are placed in wells of a tissue culture plate. After fixation, the cells on coverslips can be removed from the wells of the plate. For antibody staining, the coverslip with cells is inverted onto a small drop of antibody solution on parafilm and is covered with a second piece of parafilm to prevent drying. Using this method, only ~25 &mu;l of antibody solution is needed for each coverslip (or sample) to be stained. This protocol describes immunostaining of human neural stem/precursor cells (hNSPCs), but can be used for many other cell types.

Immunocytochemistry is a powerful method to determine the presence, subcellular localization, and relative abundance of an antigen of interest in cultured cells. This protocol presents an easy-to-follow series of steps that will enable one to conserve antibodies and get the most out of one's staining.

Imunocitoquímica: células-tronco neurais

Immunocytochemistry is a very powerful and fairly straightforward method for determining the presence, subcellular localization, and relative abundance of ...

In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos

Large size and external development of the chicken embryo have long made it a valuable tool in the study of developmental biology.  With the advent of molecular biological techniques, the chick has become a useful system in which to study gene regulation and function.  By electroporating DNA or RNA constructs into the developing chicken embryo, genes can be expressed or knocked down in order to analyze in vivo gene function.  Similarly, reporter constructs can be used for fate mapping or to examine putative gene regulatory elements.  Compared to similar experiments in mouse, chick electroporation has the advantages of being quick, easy and inexpensive.  This video demonstrates first how to make a window in the eggshell to manipulate the embryo.  Next, the embryo is visualized with a dilute solution of India ink injected below the embryo.  A glass needle and pipette are used to inject DNA and Fast Green dye into the developing neural tube, then platinum electrodes are placed parallel to the embryo and short electrical pulses are administered with a pulse generator.  Finally, the egg is sealed with tape and placed back into an incubator for further development.  Additionally, the video shows proper egg storage and handling and discusses possible causes of embryo loss following electroporation.

Chick in ovo electroporation is a technique which allows genetic manipulation of the avian embryo. Common applications of this technique include functional analysis of genes and putative enhancer elements. This video demonstrates neural tube electroporation in HH 10 chick embryos. Injection technique and proper egg handling are discussed.

Em Electroporations Ovo de Estágio HH 10 embriões de galinha

Large size and external development of the chicken embryo have long made it a valuable tool in the study of developmental biology.  With the advent of ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant interest in deriving a pure population of lineage-committed oligodendrocyte precursor cells (OPCs) for transplantation. OPCs are characterized by the activity of the transcription factor Olig2 and surface expression of a proteoglycan NG2. Using the GFP-Olig2 (G-Olig2) mouse embryonic stem cell (mESC) reporter line, we optimized conditions for the differentiation of mESCs into GFP+Olig2+NG2+ OPCs. In our protocol, we first describe the generation of embryoid bodies (EBs) from mESCs. Second, we describe treatment of mESC-derived EBs with small molecules: (1) retinoic acid (RA) and (2) a sonic hedgehog (Shh) agonist purmorphamine (Pur) under defined culture conditions to direct EB differentiation into the oligodendroglial lineage. By this approach, OPCs can be obtained with high efficiency (&gt;80%) in a time period of 30 days. Cells derived from mESCs in this protocol are phenotypically similar to OPCs derived from primary tissue culture. The mESC-derived OPCs do not show the spiking property described for a subpopulation of brain OPCs in situ. To study this electrophysiological property, we describe the generation of spiking mESC-derived OPCs by ectopically expressing NaV1.2 subunit. The spiking and nonspiking cells obtained from this protocol will help advance functional studies on the two subpopulations of OPCs.

We describe a small molecule-based protocol for differentiation of mouse embryonic stem cells into oligodendrocyte precursor cells (OPCs). This protocol generates Olig2+NG2+ OPCs with high efficiency by 30 days of differentiation. We also describe a method to generate "spiking" OPCs that can fire action potentials.

Diferenciação de células-tronco embrionárias em precursores oligodendroglial

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells (HSCs) differentiate into oligopotent progenitors, committed precursors and mature red blood cells 1. This process is regulated for a large part at the level of gene expression, whereby specific transcription factors activate lineage-specific genes while concomitantly repressing genes that are specific to other cell types 2. Studies on transcription factors regulating erythropoiesis are often performed using human and murine cell lines that represent, to some extent, erythroid cells at given stages of differentiation 3-5. However transformed cell lines can only partially mimic erythroid cells and most importantly they do not allow one to comprehensibly study the dynamic changes that occur as cells progress through many stages towards their final erythroid fate. Therefore, a current challenge remains the development of a protocol to obtain relatively homogenous populations of primary HSCs and erythroid cells at various stages of differentiation in quantities that are sufficient to perform genomics and proteomics experiments.
Here we describe an ex vivo cell culture protocol to induce erythroid differentiation from human hematopoietic stem/progenitor cells that have been isolated from either cord blood, bone marrow, or adult peripheral blood mobilized with G-CSF (leukapheresis). This culture system, initially developed by the Douay laboratory 6, uses cytokines and co-culture on mesenchymal cells to mimic the bone marrow microenvironment. Using this ex vivo differentiation protocol, we observe a strong amplification of erythroid progenitors, an induction of differentiation exclusively towards the erythroid lineage and a complete maturation to the stage of enucleated red blood cells. Thus, this system provides an opportunity to study the molecular mechanism of transcriptional regulation as hematopoietic stem cells progress along the erythroid lineage. 
Studying erythropoiesis at the transcriptional level also requires the ability to over-express or knockdown specific factors in primary erythroid cells. For this purpose, we use a lentivirus-mediated gene delivery system that allows for the efficient infection of both dividing and non-dividing cells 7. Here we show that we are able to efficiently knockdown the transcription factor TAL1 in primary human erythroid cells. In addition, GFP expression demonstrates an efficiency of lentiviral infection close to 90%. Thus, our protocol provides a highly useful system for characterization of the regulatory network of transcription factors that control erythropoiesis.

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

An ex vivo protocol to generate mature human red blood cells from hematopoietic stem/progenitors is described. Additionally we describe an efficient lentiviral-delivery method to knockdown the transcription factor TAL1 in primary erythroid cells. The efficiency of lentivirus mediated gene delivery is demonstrated using GFP expressing viruses.

Lentivirus mediada Durante Knockdown Ex Vivo Eritropoese de Células-Tronco Hematopoéticas

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has been previously shown that human somatic cells can be reprogrammed to pluripotency by ectopic expression of four transcription factors (Oct4, Sox2, Klf4 and Myc) and become induced pluripotent stem cells (iPSCs)2-4 . Like hESCs, human iPSCs are pluripotent and a potential source for autologous cells. Here we describe the protocol to reprogram human fibroblast cells with the four reprogramming factors cloned into GFP-containing retroviral backbone4. Using the following protocol, we generate human iPSCs in 3-4 weeks under human ESC culture condition. Human iPSC colonies closely resemble hESCs in morphology and display the loss of GFP fluorescence as a result of retroviral transgene silencing. iPSC colonies isolated mechanically under a fluorescence microscope behave in a similar fashion as hESCs. In these cells, we detect the expression of multiple pluripotency genes and surface markers.

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

A method to generate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) via retrovirus-mediated ectopic expression of OCT4, SOX2, KLF4 and MYC is described. A practical way to identify human iPSC colonies based on GFP expression is also discussed.

Reprogramação de células somáticas humanas em células tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) usando vetor retroviral com GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

Indução e Análise de epitelial para mesenquimal Transição

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...