Pré-iadipócitos primários são um valioso sistema experimental para entender as vias moleculares que controlam o metabolismo de adipócitos. Os embriões de frango oferecem a oportunidade de isolar os preadipócitos do estágio inicial do desenvolvimento de adipócitos. Este método tem sido otimizado para produzir células com alta viabilidade e capacidade aumentada de diferenciação em adipócito maduro, que pode ser usado para análise funcional do crescimento precoce da gordura e desenvolvimento de embriões em filhotes.
O processo de diferenciação adipogênica é altamente comparável entre galinhas e humanos. Portanto, preadipócitos isolados podem ser usados como modelo duplo proposto para estudos relevantes para humanos e aves. Para começar, limpe o corpo do embrião com 70% de etanol.
Em seguida, para evitar interferência durante a filtragem em etapas posteriores após a digestão esfregou suavemente a superfície da pele com gaze estéril para remover penas. Em seguida, corte a pele entre as pernas e a região abdominal para revelar o par de depósitos de adiposos femorais. Use fórceps curvos com uma mão para segurar a pele ao redor da perna e remova suavemente a gordura subcutânea femoral.
com a outra mão. Mais tarde, use fórceps curvos para puxar suavemente o depósito para longe da perna. Transfira os tecidos para um tubo de 15 mililitros contendo cinco mililitros de mídia de coleta e repita a dissecção para o outro lado da almofada de gordura.
Agora, transfira as almofadas de gordura coletadas para uma placa de Petri de 60 milímetros contendo solução de esterilização e enxágue brevemente girando o prato algumas vezes. Em seguida, enxágue a solução de esterilização transferindo as almofadas de gordura para uma placa de Petri de 60 milímetros contendo PBS. Gire suavemente a placa e, mais uma vez, lave com PBS.
Para a digestão dos tecidos adiposos, transfira-os para um tubo de 15 milímetros contendo solução enzimática pré-quente. Em seguida, mergulhe um par de tesouras longas retas no tubo e, finalmente, pique os tecidos adiposos na solução em pedaços o menor possível. Transfira o tecido picado e a solução enzimática para um frasco autoclavado de 25 mililitros.
Enrole o frasco com filme de parafina e coloque o frasco em uma incubadora de shaker orbital a 37 graus Celsius para digestão. Após a digestão, bato suave para cima e para baixo para misturar bem. Em seguida, remova qualquer pedaço de tecido e detritos não digeridos filtrando através de um coador de tecido de 250 micrômetros em um tubo de 15 mililitros por pipetação.
Agora, remova as células aderidas ao frasco enxaguando o frasco com quatro mililitros de mídia de crescimento e filtrar a suspensão celular no mesmo tubo de 15 mililitros. Em seguida, enxágue o coador, canalizar novamente a mídia de crescimento para remover quaisquer células presas no filtro. Centrifugar a 300 vezes G por cinco minutos à temperatura ambiente para pelotar a fração celular e aspirar o supernatante sem perturbar a pelota celular.
Levemente resuspenque a pelota em um mililitro de tampão de lise de glóbulos vermelhos, misture bem por pipetar e incubar por cinco minutos em temperatura ambiente. Em seguida, diluir as células adicionando cinco mililitros de mídia de crescimento ao tubo contendo as células e misturá-las suavemente por pipetação. Agora, pipeta as células em um coador de células de 40 micrômetros e filtra-as em um novo tubo de 50 mililitros.
Em seguida, enxágüe o coador com mais cinco mililitros de mídia de crescimento e pelota as células por centrifugação a 300 vezes G por sete minutos em temperatura ambiente. Aspire cuidadosamente o supernatante. Resuspende a pelota celular restante em um mililitro de mídia de crescimento por pipetação Para determinar a densidade e viabilidade celular, misture 10 microliters de cada amostra em azul trypan por pipetação.
Coloque 10 microliters da mistura no hemótmetro e conte as células. A análise dos pré-apócitos após 24, 48 e 72 horas mostrou morfologia celular normal e número. A indução adipogênica de preadipócitos mostrou rápida diferenciação e acúmulo de gotículas lipídicas.
O manuseio agressivo de preadipócitos durante o isolamento resultou em danos celulares e baixo número de células. A contaminação microbiana pode ser observada apesar de tomar medidas preventivas. A coloração lipídica com óleo vermelho O indicou que os preadipócitos rapidamente começam a desenvolver gotículas lipídicas sob incentivo adipogênico e o acúmulo progride ao longo do tempo, como observado em 24, 48 e 72 horas.
O acúmulo de lipídios em relação ao número celular foi quantificado por manchas lipídicas e de DNA. Tanto o acúmulo de lipídios quanto a proliferação celular aumentaram com o tempo. O baixo número celular ou células danificadas podem ser observados quando as frações teciduais são digeridas por muito tempo.
Portanto, recomenda-se que uma hora e meia de digestão não seja excedida. Preadipócitos isolados podem ser usados para estudos de expressão genética. RNA suficiente pode ser obtido para uso na síntese cDNA e follow-on qPCR ou RNAseq.
