A capacidade de adquirir grandes quantidades de dados de experimentos de imagem de cálcio melhorou drasticamente, especialmente com experimentos de imagem tecidual. Nossos protocolos descrevem técnicas de análise apropriadas para quantificar e descrever esses conjuntos de dados. Nossos protocolos geram uma gama de valores espaciais, temporais e de intensidade que são intrínsecos à sinalização de cálcio em tecidos inteiros e isso pode ser perdido em análises mais rudimentares.
Uma hora antes da transferência de imagem, um intestino delgado colhido de um rato com células intersticiais de Cajal ou ICC que expressam especificamente um indicador de cálcio geneticamente codificado para o estágio de um microscópio confocal de disco giratório. E perfundir continuamente o tecido com 37 graus Celsius Biocarbonato Krebs-Ringer ou solução KRB. Usando uma ampliação de 60 a 100 X localize o plexo mienterico em forma de stellate ICC ou ICC-MY entre as camadas musculares suaves circulares e longitudinais do intestino delgado.
Em seguida, localize o plexo muscular profundo em forma de fuso ICC ou ICC-DMP em um único plano entre a camada muscular suave circular e o plexo submucosal e salve os filmes como uma pilha de imagens TIFF. Para criar mapas espátulais ou STMs da atividade de cálcio ICC-DMP abra a pilha de imagens no ImageJ e clique em Imagem, Tipo e 32 bits para modificar a qualidade da imagem. Para criar uma varredura de linha clique com o botão direito do mouse na ferramenta de seleção de linhas e selecione linha segmentada.
Usando cliques únicos à esquerda, desenhe uma linha ao longo do acesso médio de um ICC-DMP individual, clicando duas vezes quando toda a célula foi delineada. Selecione Imagem, Pilhas e Reslice. Uma janela pop-up aparecerá.
Selecione Girar 90 graus para orientar a varredura de linha da esquerda para a direita para que possa ser calibrada e ler contra o tempo no eixo x com espaço no eixo y e clique em OK. O mapa espacial aparecerá. Para medir com precisão a amplitude dos sinais de cálcio do mapa, selecione a seleção retangular e desenhe uma região de interesse ao redor da área dentro do STM que exibe a área mais uniforme e menos intensa de fluorescência. Clique em Analisar e Histograma para obter um valor médio da intensidade dentro da região de interesse selecionada e clique em Editar, Selecionar Tudo para selecionar todo o STM.
Em seguida, clique em Process, Math e Divide e digite o valor médio da intensidade com a região stm selecionada de interesse na caixa pop-up. O STM vai ficar preto. Corrija isso clicando em Imagem, Ajuste, Brilho/Contraste e Auto na janela pop-up.
A varredura da linha será agora calibrada para a amplitude com a intensidade da fluorescência expressa como a fluorescência dividida pela fluorescência zero. O STM exibirá o número de quadros na pilha TIFF no eixo x e o número de pixels que representam o comprimento da célula no eixo y. Para quantificar os dados temporais e espaciais dos sinais de cálcio clique em Imagem e Propriedades e insira os valores apropriados para calibrar totalmente o STM para espaço e tempo na janela pop-up.
Para analisar os eventos individuais de cálcio clique em Linha Reta e clique e arraste no STM para desenhar uma linha horizontal reta através do centro de um evento de cálcio paralelo ao eixo x. Em seguida, clique em Analisar e Traçar perfil. Uma caixa aparecerá mostrando o perfil da trama do evento de cálcio.
Para análise baseada em partículas dos dados de sinalização de cálcio ICC-MY, abra o arquivo de filme em Volumetry e clique com o botão direito do mouse para selecionar O Filtro STK, Diferencie. Clique com o botão direito do mouse novamente para inserir um valor para diferenciar. Pressione Enter e clique à esquerda para iniciar a diferenciação.
Para criar partículas, use o botão do mouse do meio para percorrer o filme para selecionar uma seção de 20 a 40 quadros que inclui um período quiescente, seguido pela ocorrência de um cluster transitório de cálcio e 20 a 40 quadros que seguem logo após o cluster. Quando todos os quadros tiverem sido selecionados com o botão direito do mouse na janela do filme para acessar informações de partículas STK OPS Ramp DS e clique para executar uma rotina de análise de partículas que aumenta progressivamente o limiar do máximo para a intensidade mínima. Para garantir uma análise bem sucedida de partículas, certifique-se de incorporar o máximo de não-atividade de cluster transitório pré-cálcio e o máximo de não-atividade de cluster transitório pós-cálcio que puder.
Isso ajudará a aumentar a relação sinal-ruído. A análise será exibida graficamente na janela da parcela como enredo de ruído e na janela de traços como três traços de cor com o traço verde representando o número de partículas, o traço vermelho representando o tamanho médio da partícula, e o traço azul representando o limiar de intensidade absoluta. Para equilibrar o gráfico de ruído de partículas pressione H no teclado.
Em seguida, pressione a tecla de suporte direito para percorrer esquemas de cores até que o fundo esteja branco com os traços de cor na parte superior. Pressione F no teclado uma vez para trazer uma ferramenta de medição. Em seguida, pressione F uma segunda vez para marcar uma única linha vertical na barra de rolagem da janela de traços na trama no cruzamento onde as parcelas coloridas começam a mudar para o lado direito.
Dentro da janela de traços use o botão do mouse do meio para rolar do ponto de inflexão do traço vermelho para a linha vertical branca marcada. Depois de notar a média Y exibida, clique novamente no botão do mouse do meio dentro da janela de traços para desmarcar o traço azul. Na janela do filme clique em C para trazer uma roda colorida e D para ajustar o limiar.
Partículas válidas serão agora mostradas em vermelho, e aquelas que saturam serão brancas. Use o botão do mouse esquerdo para rolar até que as áreas brancas sejam removidas e use o botão do mouse médio para ajustar o valor numérico amarelo na roda de cor ao valor médio de Y para atribuir tudo em vermelho como uma partícula transitória de cálcio ativa no ponto de limiar determinado. Para salvar os dados como um arquivo de partículas baseado em coordenadas clique com o botão direito do mouse para acessar o STK 3D, salve a partícula zero e clique à esquerda para salvar o arquivo.
Para criar mapas de calor de atividade de partículas abra o arquivo de partículas salvo e clique com o botão direito do mouse na janela do filme para acessar STKops de partículas, StatMap Flag e digitar atribuições de bandeira para analisar. Clique para aplicar a análise e um mapa de calor mostrando as partículas totais para todo o comprimento da gravação com cores diferentes representando a porcentagem de ocorrência ao longo do registro. Clique com o botão direito do mouse para salvar o mapa de calor como um arquivo TIFF.
Em seguida, clique com o botão direito do mouse na janela do filme para acessar a medida de partículas, as estatísticas de partículas STK são iguais e digite uma atribuição de bandeira para a análise. Uma série de vestígios serão gerados na janela de rastreamento. A análise stm fornece a capacidade de monitorar e registrar as características espaciais da sinalização de cálcio, como a propagação espacial e a velocidade de propagação.
Essas informações podem ser acumuladas para fornecer uma visão bastante completa dos comportamentos de sinalização de cálcio dentro das células em seus ambientes nativos. Por meio da análise de partículas, informações quantitativas sobre a sinalização de cálcio podem ser calculadas medindo a área de partículas e a contagem de partículas, que juntas podem ser usadas para determinar as faixas espaciais de ativação de sinal de cálcio dentro de um campo de visão especificado. A análise de partículas também permite a quantificação aprofundada da sinalização subcelular de cálcio através do exame do local e das probabilidades de disparo de locais de disparo de cálcio.
Ao alocar as partículas em diferentes bandeiras com base em suas características temporais, as partículas iniciantes podem ser mapeadas com precisão. E uma riqueza de dados concretos adquiridos sobre o número de locais de iniciação, o tamanho do site em pixels e micrômetros, a probabilidade de cada local de iniciação disparar uma ou várias vezes durante cada aglomerado transitório de cálcio, e a porcentagem de locais de disparo que disparam durante cada ciclo de cluster transitório de cálcio podem ser obtidos. Consistência é a chave para o sucesso neste protocolo.
Todos os conjuntos de dados e todos os filmes devem ser tratados exatamente da mesma forma para garantir resultados confiáveis e repetíveis. Isso é especialmente verdade quando se lida com arquivos de partículas. Nossos protocolos permitem uma caracterização profunda da sinalização de cálcio in situ, e uma série de métodos estatísticos, quando usados adequadamente, podem avaliar diferenças entre uma gama de parâmetros espaciais e temporais.
Essas técnicas de análise em nosso protocolo permitiram que os pesquisadores fizessem e respondessem perguntas antes não abordadas relacionadas ao ritmo intestinal e à inervação intestinal, bem como ao controle neuronal do trato urinário inferior.
