Prepare o rato para a cirurgia. Raspe os quadrantes inferiores do abdômen usando uma navalha e desinfete a área com iodo. Coloque o mouse sobre uma superfície de trabalho limpa em suas costas com a cabeça apontando para longe do operador.
Faça uma incisão longitudinal da pele de cerca de meio centímetro de comprimento no abdômen inferior esquerdo. Tenha cuidado para não penetrar na cavidade peritoneal. Use uma tesoura pequena para estender a incisão de cerca de um a dois centímetros.
Faça uma incisão intramuscular para ter acesso à cavidade peritoneal. Na maioria dos casos, o ceco está no lado esquerdo do abdômen. Isolar o ceco.
Usando fórceps anatômicos, expõe suavemente e cuidadosamente o ceco através da incisão. O passo quatro é a ligadura. A posição da ligadura no ceco determina o nível de gravidade da sepse.
Ligar aproximadamente 75% do ceco induz sepse grave. Ligando 50% do ceco induz sepse de nível médio. Considerando que ligar 25% ou menos do ceco resultará em sepse menor.
Ligate o ceco na posição designada. Certifique-se de não ligar a válvula ileocecal. O passo cinco é perfurar o ceco.
Usando uma agulha, perfure o ceco com uma única perfuração no meio da via entre a ligadura e a ponta do ceco. Certifique-se de não perfurar nenhum vaso sanguíneo. Para garantir que houve uma punção completa, extrude uma pequena gota de fezes de ambos os buracos de agulha.
Substitua cuidadosamente o ceco na cavidade abdominal. Feche a musculatura abdominal aplicando suturas simples e feche a pele. Limpe a pele com iodo.
Injete no mouse uma solução salina pré-aquecida para ressuscitar. Coloque o rato de volta na gaiola com acesso ilimitado a comida e água. Após cerca de três dias da ligadura cecal e punção ou o procedimento de CLP, submetemos o rato a um segundo golpe com uma infecção intranasal para estimular pneumonia que ocorre frequentemente na sepse.
Aproxime-se do pescoço do mouse por trás, suavemente e suavemente. O polegar e o dedo indicador da mão esquerda formam uma posição em forma de U. Segure o pescoço imediatamente atrás das orelhas para que a cabeça do rato esteja completamente contida.
Introduza a infecção intranasal. Usando uma pipeta de 100 microliter, incutir a cepa staphylococcus aureus intranasally. Segurando o mouse em uma posição vertical, lentamente deixe cair de dois a três microliters da solução bacteriana em ambas as narinas do mouse.
Levante o mouse para cima e para baixo com a cabeça para cima e para baixo para ajudar a solução bacteriana a entrar na traqueia. Levante o mouse rapidamente enquanto o reduz suavemente e lentamente. Repita a instilação 15 vezes ou até que toda a solução bacteriana esteja incutir.
O último passo é terminar o procedimento. Coloque o rato na cama angular em um ângulo de cerca de 35 graus para se recuperar. Certifique-se de que o mouse está de costas com a cabeça deitada.
Observe o mouse para ter certeza de que ele está completamente recuperado da anestesia e do procedimento. Depois de achatar a cama, coloque o rato de volta na gaiola com acesso ilimitado a comida e água. Camundongos começaram a morrer cerca de 12 horas após a indução de peritonite.
A mortalidade foi muito maior para camundongos com CLP antes de uma pneumonia. Três dias após a cirurgia, os camundongos CLP tiveram mais mortalidade com uma administração intranasal de staphylococcus aureus. Os níveis de citocinas pró-inflamatórias do soro aumentaram significativamente em 24 horas após a instilação bacteriana em camundongos de sepse em comparação com os camundongos que tinham CLP sozinhos ou os camundongos operados por Sham com um segundo impacto.
No entanto, camundongos de duplo impacto apresentaram diminuição significativa nos níveis de citocina de fluido BAL em comparação com a cirurgia SA e Sham mais os camundongos SA. Assim, o CLP prejudica a defesa do hospedeiro e aumenta a suscetibilidade à infecção. Este modelo de duplo impacto é uma ferramenta valiosa para entender os mecanismos moleculares de interação hospedeiro-patógeno, que podem abrir o caminho para desenvolver novas drogas eficazes e outras terapêuticas para infecções por superinsetos.
