Este protocolo instala a preparação de uma solução de trabalho de grânulos para estudos in vivo, bem como a preparação de soro contendo grânulos para experimentos in vitro. Uma vantagem dessa técnica é que o método pode ser facilmente repetido devido ao baixo custo dos materiais e dos animais que você cria para os experimentos. Comece adicionando oito, 16 e 24 gramas de Gushukang, ou GSK, grânulos a tubos individuais de 50 mililitros.
Adicione 48 mililitros de água a cada tubo e agite os tubos para dissolver completamente os grânulos. Em seguida, coloque 1,6 comprimidos de carbonato de cálcio suplementados com vitamina D3 em outro tubo de 50 mililitros, e dissolva os comprimidos em 48 mililitros de soro fisiológico com agitação. Para a administração intragástrica das soluções, primeiro, levemente, mas firmemente, contenha manualmente um mouse C57 Black 6 de um mês de idade por dois a três minutos.
Quando o rato tiver se acalmado, carregue uma agulha de 40 milímetros, número 12, com 0,24 mililitros de uma solução de trabalho de grânulos GSK, e coloque a agulha de gavage no rato através de um lado de sua boca até que a resistência da agulha seja sentida, indicando que a agulha atingiu o estômago. Injete todo o volume de solução de trabalho no animal. Em seguida, retraia a agulha de gavage, e devolva o rato para sua gaiola enquanto os outros ratos estão sendo administrados GSK antes de injetar 0,24 mililitros de carbonato de cálcio e vitamina D3 solução em cada rato da mesma maneira.
Para a coleta de soro de sangue contendo GSK, depois de entregar as concentrações apropriadas de GSK a um rato por gavage como apenas demonstrado, confirme a falta de resposta para beliscar o dedo do dedo uma hora após a última administração de grânulos GSK. Faça uma pele abdominal e incisão peritoneal, e exponha o abdômen até a parte inferior do tórax. Use papel de tecido para remover o tecido conjuntivo da aorta abdominal para expor o vaso claramente, e use uma seringa de 10 mililitros equipada com uma agulha de calibre 22 para extrair sangue da aorta.
Transfira o sangue para um tubo estéril de 15 mililitros e coloque o tubo ereto à temperatura ambiente por 30 a 60 minutos. Quando o sangue tiver coagulado, centrifugar o tubo para separar o soro, e transferir todo o soro para até seis ratos em um novo tubo de 50 mililitros. Agite o tubo para misturar a soro antes de inativar os componentes do soro em um banho de água Celsius de 56 graus por 30 minutos.
Em seguida, filtre o soro através de um filtro de seringa poliéfilo de tamanho de 0,22 micrômetros para armazenamento a menos 80 graus Celsius por até um ano. Para osteoclastogênese in vitro, diluir as três doses de soro contendo GSK em uma proporção de um para quatro com o meio mínimo da Águia suplementado com L-glutamina, ribonucleosídeos e desoxiribonucleosídeos. Adicione 200 microliters de cada diluição a cada poço de uma cultura macrófago de medula óssea em uma placa de 96 poços.
Em seguida, inicie a geração osteoclasta estimulando cada poço com fator estimulante da colônia de macrófagos e ativador receptor para o ligante fator nuclear-kappa B. Para osteoblastogênese in vitro, adicione dois mililitros de soro contendo GSK diluídos a cada poço de uma cultura de células-tronco mesenquimal de 24 poços. Resultados de tomografia computadorizada microcomputadas indicam que camundongos ovariectomizados demonstram perda óssea significativa em comparação com camundongos de controle salino.
A intervenção com 90 dias de tratamento de grânulo GSK aumenta muito a densidade da medula óssea, particularmente em animais tratados com GSK de dose média. O tratamento do grânulo GSK também leva a um aumento do número ósseo trabecular, volume ósseo acima do volume total e espessura óssea trabecular, mas uma diminuição da separação óssea-trabecular óssea. Fosfatase de ácido resistente a tartaratos, ou TRAP, a coloração revela um aumento no número de osteoclatos em camundongos ovariectomizados em comparação com animais de controle, enquanto os tratamentos de granulo GSK diminuem a diferenciação de osteoclastafatopositivo trap em comparação com os animais ovariectomizados.
O soro contendo granuloso GSK também reduz o número de osteoclastas trap-positivas em comparação com o soro coletado de animais de controle. A penetração bem sucedida da agulha na aorta abdominal é fundamental para garantir que um sangue de volume alto o suficiente seja colhido de cada rato. Uma execução bem sucedida deste método deve acoplar o acúmulo de 15 a 20 milímetros de sangue, material suficiente para ser usado para experimentos in vitro.
