Micropartículas de hidrogel de matriz extracelular ou MEC numéricas podem ser usadas como blocos de construção para a fabricação de andaimes. Este protocolo demonstra a fabricação, purificação, liofilização, montagem de fotos e bioimpressão 3D de micropartículas de metacriloíla de gelatina ou hidrogel GelMA. GelMA é um biopolímero fotoquímico, reticulável, à base de proteínas, contendo adesivo celular e metades biodegradáveis que tem sido amplamente utilizado como um biomaterial instrutivo e responsivo a células.
Em comparação com o hidrogel convencional a granel, os suportes de hidrogel granular GelMA são microporosos, permitindo uma rápida infiltração celular que pode ser adaptada pelo tamanho do bloco de construção. Os scaffolds de hidrogel granular GelMA podem abrir novas oportunidades para a bioimpressão 3D de tecidos, órgãos e doenças espessos em plataformas baratas e engenharia regenerativa. Para começar, adicione 10 miligramas de LAP a 10 mililitros de DPBS para preparar uma solução de fotoiniciador a 0,1%.
Proteja a solução da luz, envolvendo-a com papel alumínio e rotule-a. Em seguida, dissolver a quantidade desejada de GelMA na solução do fotoiniciador. Coloque a solução embrulhada em folha de alumínio no forno de 37 graus Celsius por uma hora para obter uma solução clara.
Para preparar a fase oleosa, faça uma solução de surfactante biocompatível a 2% no fluido de engenharia. Insira o tubo Tygon nas entradas e saídas do dispositivo PDMS e, em seguida, insira uma agulha romba de calibre 25 na outra extremidade do tubo Tygon para entradas. Coloque o dispositivo sob o microscópio e mantenha o ambiente aquecido a aproximadamente 40 graus Celsius usando um secador de cabelo ou um aquecedor de ambiente.
Coloque as soluções aquosas e oleosas em seringas separadas conectadas ao dispositivo. Ligue a bomba de seringa para a fase oleosa com uma vazão de 160 microlitros por minuto. Depois que o óleo encher o canal, inicie a fase aquosa a 80 microlitros por minuto.
Verifique a formação de gotículas ao microscópio. Coletar as gotículas em um recipiente e avaliá-las na câmara de imagem por microscopia óptica. Mantenha as gotículas a quatro graus Celsius durante a noite, protegendo-as da luz para iniciar a reticulação física do microgel GelMA e converter as gotículas em microgéis estáveis.
Para implementar o método de emulsão em pó microprojetado, MEtoP, colete os microgéis reticulados fisicamente no fluido de engenharia usando tubos de microcentrífuga termicamente duráveis ou criofras. Sele o tubo aberto com um lenço e fita adesiva de laboratório. Congelar os microgéis fisicamente reticulados em nitrogênio líquido por 10 minutos para prosseguir com a liofilização.
Após liofilização, um pó sólido será obtido. Adicione um mililitro de solução resfriada a 0,1% do fotoiniciador a quatro graus Celsius ao pó liofilizado para fazer suspensões de microgel. Centrifugar a mistura de vórtice a 3.000g por 15 segundos.
Depois de descartar o sobrenadante, transfira a suspensão de microgel embalada para um molde usando uma pipeta de deslocamento positivo e exponha à luz no comprimento de onda de 400 nanômetros com uma intensidade de 15 miliwatts por centímetro quadrado por 60 segundos para formar arcabouços de hidrogel granular ou GHS. Para 400 microlitros de suspensão de microgel, adicione uma quantidade igual de solução de PFO gelada, 20% em fluido de engenharia aos microgéis GelMA reticulados fisicamente. Em seguida, centrifugar a mistura de vórtice a 300g por 15 segundos e remover a fase oleosa dos microgéis GelMA por pipetagem.
Em seguida, adicione 400 microlitros de solução gelada de fotoiniciador a 0,1% à suspensão de microgel. Depois de centrifugar a solução de vórtice a 300g por 15 segundos, descarte o óleo. Repita as etapas de adição e centrifugação da solução do fotoiniciador, mas centrifugar a 3.000g desta vez e descartar o sobrenadante dos microgéis GelMA embalados.
Transfira os microgéis GelMA embalados para um molde, seguido de exposição à luz para formar o GHS. Adicione 100 miligramas de pó de nanoplaquetas a três mililitros de água gelada e ultrapura para formar uma dispersão de nanopartículas de 3,33%. Vórtice a dispersão vigorosamente dentro de um refrigerador de quatro graus Celsius por 15 minutos para esfoliar as nanopartículas agregadas.
Nanopartículas adequadamente esfoliadas produzem uma dispersão clara. Dissolva 50 miligramas de LAP em cinco mililitros de água gelada e ultrapura para preparar uma solução estoque de fotoiniciador a 1%. Em seguida, adicione 333 microlitros de solução fotoiniciadora a 1% à dispersão de nanopartículas esfoliadas e envolva-a em papel alumínio para proteger contra a luz ambiente.
Vórtice a mistura por um minuto para misturar a dispersão de nanopartículas e o fotoiniciador. Adicione PFO gelado, 20% em fluido de engenharia aos microgéis GelMA reticulados fisicamente em uma relação de volume de um para um. Após centrifugar a mistura de vórtice a 300g por 15 segundos, descarte a fase oleosa que contém o tensoativo.
Adicione a dispersão de nanopartículas gelada e suplementada com ALP aos microgéis GelMA lavados. Após centrifugar a 3.000g por 15 segundos, descarte o óleo restante no fundo e a dispersão do sobrenadante. Armazene a suspensão a quatro graus Celsius enquanto a protege da luz usando papel alumínio por um dia para produzir o produto GelMA nanoengineered granular bioink ou NGB.
No dia seguinte, carregue o NGB em uma seringa de três mililitros. Sele a seringa carregada com tampa e parafilme e faça uma centrifugação por pulso a 200g para remover o ar aprisionado. Transfira a biotinta para um cartucho de três mililitros usando um conector Luer fêmea-fêmea.
Centrifugar o cartucho brevemente a 200g novamente para remover o ar preso e manter o NGB a quatro graus Celsius antes de usar. Em seguida, carregue a suspensão de células de fibroblastos murinos preparada em uma seringa de três mililitros. Junte o NGB e as seringas carregadas com células usando um conector Luer fêmea-fêmea e misture o conteúdo suavemente empurrando para frente e para trás 40 vezes.
Imprima o NGB ou NGB carregado de células usando uma bioimpressora apropriada com um bocal cônico padrão carregando o bocal na cabeça de impressão de três mililitros. Mantenha a temperatura da cama de impressão abaixo de 10 graus Celsius e otimize parâmetros como velocidade e contrapressão. Selecione o arquivo gcode ou STL desejável.
Em seguida, selecione o substrato e o tipo de bico para uma seringa pneumática de três mililitros equipada com um bico cônico padrão. Calibre a bioimpressora usando as diretrizes do dispositivo e comece a imprimir para obter as estruturas 3D. A tecnologia MEtoP produziu pó de microgel seco ressuspendível por liofilização a baixa pressão, protegendo os microgéis da agregação e deformação severa.
As imagens de MEV mostraram que as micropartículas secas de GelMA usando esta tecnologia mantêm sua forma esférica após liofilização em comparação com a agregação observada com a liofilização convencional. A caracterização de microporos de GelMA, GHS e NGB com um corante de fluorescência de alto peso molecular mostrou os espaços vazios de microescala interconectados. Além disso, a imagem de fluorescência avaliada usando um script MATLAB personalizado detectou os poros.
As medidas de fração de vazio e diâmetro equivalente de poro mediano não mostraram diferença significativa atestando a disponibilidade e interconectividade de poros em microescala nos scaffolds impressos em 3D usando o NGB. A superioridade dos scaffolds NGB em relação aos microgéis GelMA compactados e apertados pela medida do comprimento do filamento suspenso revelou que NGB tinha um comprimento maior do que os microgéis embalados. Os microgéis frouxamente embalados não produziram filamentos.
Um cilindro oco foi impresso em 3D, e toda a construção foi exposta à luz para fotoreticulação. A estrutura impressa foi fisicamente mantida para mostrar a forma, fidelidade e integridade estrutural. Se o andaime for usado para avaliação biológica, por exemplo, na bioimpressão carregada de células, lembre-se de realizar todas as etapas sob determinadas condições, sob o gabinete de segurança biológica.
Esperamos descomercializar o uso de arcabouços de hidrogel granular como uma plataforma de biomateriais recém-emergida em biomedicina.
