Este vídeo mostra como preparar dois tipos diferentes de substratos de cultura celular usando o colágeno tipo I e o método de cultura bidimensional e tridimensional. O método de cultura tridimensional é considerado para o ambiente biológico, demonstrando como preparar facilmente um substrato de cultura tridimensional é útil para estudos. Em numerosos tipos de células, apesar de usar o mesmo colágeno, o comportamento celular varia consideravelmente entre substratos bidimensionais e tridimensionais.
Usando substrato de cultura tridimensional, o comportamento celular mais semelhante ao dos organismos vivos poderia ser facilmente examinado. Este método é muito simples e requer um reagente especial mínimo. A demonstração visual é crítica, porque enquanto queremos demonstrar que este método é facilmente tentado, o gel tridimensional é frágil, e manuseá-lo corretamente é muito importante.
Para começar, prepare o meio de cultura adequado. Para começar a preparar o colágeno, coloque 10x PBS, água desionizada, colágeno, uma placa de cultura de 96 poços, e um tubo vazio de dois mililitros no gelo. Usando uma pipeta, adicione 1,12 mililitros de água deionizada ao tubo vazio de dois mililitros.
Adicione 200 microliters de 10x PBS à água deionizada, e agite suavemente o tubo várias vezes. Imediatamente antes do uso, adicione 0,66 mililitros de colágeno ao tubo de dois mililitros. Agite suavemente e rapidamente o tubo várias vezes.
Despeje 100 microliters desta solução de colágeno em cada poço da placa de cultura de 96 poços, certificando-se de cobrir toda a superfície dos poços. Agite suavemente a placa usando um movimento da esquerda para a direita. Incubar a placa de cultura em uma incubadora de dióxido de carbono a 37 graus Celsius por uma hora.
Em seguida, incline a placa para confirmar a gelação do colágeno, e mova a placa de cultura para um banco limpo. Despeje suavemente 150 microliters de K110 sobre os géis, pipetando ao longo da parede do poço. Incubar em uma incubadora de dióxido de carbono a 37 graus Celsius por uma hora.
Depois disso, mova a placa de cultura para um banco limpo. Imediatamente antes da cultura celular, use uma pipeta para descartar suavemente o K110. Primeiro use uma pipeta para adicionar quatro microliters de colágeno a 1,2 mililitros de um ácido clorídrico mililitro em um tubo de 1,5 mililitro, e misturar suavemente.
Despeje 100 microliters desta mistura de colágeno em cada poço de uma nova placa de cultura de 96 poços. Agite suavemente a placa em um movimento da esquerda para a direita e incubar em temperatura ambiente por uma hora. Depois disso, descarte a solução de colágeno.
Usando uma pipeta, lave cada poço com PBS. Adicione 150 microliters de 1%BSA e PBS a cada poço da placa de cultura, e incubar em temperatura ambiente por uma hora. Antes da cultura celular, descarte a solução 1%BSA.
Para começar, prepare as células FEPE1L-8 e o K110, trypsin e inibidor de trippsina, conforme descrito no protocolo de texto. Remova cuidadosamente o meio do prato de cultura e use uma pipeta para adicionar três mililitros de 0,05% de trippsina. Coloque o prato de volta na incubadora de dióxido de carbono e incubar a 37 graus Celsius por cinco minutos.
Em seguida, use microscopia de contraste de fase em 10x de ampliação para verificar se há descolamento celular da superfície do prato de cultura. Adicione três mililitros de inibidor de trippsina, e use uma pipeta para coletar as células separadas em um tubo de centrífuga de 15 mililitros. Centrifugar a 200 vezes g por cinco minutos.
Depois disso, descarte o supernasce, e resuspense a pelota em 10 mililitros de K110. Use microscopia de contraste de fase em 10x de ampliação para contar as células, e diluir as células com K110 para uma densidade celular de 50.000 células por mililitro. Semente suavemente 0,1 mililitro da suspensão celular em cada poço da placa de cultura, pipetando ao longo da parede do poço.
Incubar em uma incubadora de dióxido de carbono a 37 graus Celsius pelo período de tempo adequado. Misture primeiro 130 microliters de sal de tetrazolium e WST-8 com 1,3 mililitros de K110 pré-aquecido em um tubo de dois mililitros. Mova a placa de cultura para um banco limpo e use uma pipeta para descartar suavemente o K110 dos poços.
Lave suavemente as células não aadeentes com K110. Em seguida, adicione 110 microliters de K110 misturados com WST-8 a cada poço. Incubar em uma incubadora de dióxido de carbono a 37 graus Celsius por duas horas.
Depois disso, mova a placa de cultura para um banco limpo. Colete 100 microliters do meio condicionado de cada poço, e mova-o para os poços de uma nova placa de cultura de 96 poços. Usando um leitor de microplacão, meça a absorvância em 450 nanômetros e estime o número de células viáveis.
A morfologia celular é observada nas formas não fibrosas e fibrilas são mostradas aqui. Nas duas primeiras horas de cultivo, as células aderem e se espalham em ambas as formas de colágeno. Três dias após a semeadura, as células na forma não fibrosa continuam a se espalhar, e o número de células aumenta, enquanto as células na forma fibrila mostram propagação limitada.
As células FEPE1L-8 continuam a proliferar na forma não fibrosa do colágeno tipo I e nas superfícies do prato não tratada. Em contraste, as células não proliferam na forma fibrila. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que o gel tridimensional é muito frágil.
É preciso ter cuidado para garantir que a solução ou as pontas não entrem em contato direto com os géis. Este método pode ser modificado de várias maneiras. Por exemplo, para misturar os componentes da membrana da amostra, pode-se fazer um substrato de cultura celular que imita uma membrana de porão.
Em inúmeros casos, as funções da matriz extracelular em corpos vivos são desconhecidas. Para as células culturais da cultura tridimensional, pode-se examinar a função do componente da matriz extracelular que é mais semelhante ao corpo vivo. Aplicando técnicas tridimensionais de cultura gel, pode-se efetivamente testar a concentração de drogas nas células.
Este protocolo, baseado no propósito, poderia ser usado para desenvolver substratos complexos de cultura tridimensional, misturando outros componentes EGM ou fatores de crescimento durante as gelações.
