Delineamos um procedimento para detectar e quantificar o ácido iofenoxico no soro de mangusto. Os resultados sugerem que o ácido iofenoxico pode ser usado como um marcador biológico para verificar a absorção beta na espécie. A principal vantagem deste método é que ele permite a quantificação de análogos de ácido iofenoxico em partes por bilhão de níveis, usando uma técnica simples de executar precipitação proteica.
Para a fase móvel A, combine um mililitro de ácido fórmico com um litro de água ultra pura. Para a fase móvel B, combine um mililitro de ácido fórmico com um litro de acetonitrila. Para o diluente, combine um mililitro de ácido trifluoroacético com 200 mililitros de acetonitrilo.
Em seguida, pese aproximadamente 10 miligramas de metil-IPA em microequilípmo, e registe a massa para mais ou menos 0001 miligramas. Transfira quantitativamente o metil-IPA para um frasco volumoso classe A de 10 mililitros, usando quatro a cinco mililitros de acetonitrilo. Sonicate por um minuto para dissolver todos os sólidos e, em seguida, trazer a volume com acetonitrilo.
Transfira aproximadamente oito mililitros de cada estoque para oito frascos de vidro âmbar mililitro com tampas forradas com PTFE e armazene as amostras à temperatura ambiente. Em seguida, transfira o estoque restante para resíduos perigosos. Para o estoque 25X, sete estoques de metil-IPA preparam um estoque de metil-IPA e acetonitrilo a aproximadamente 200 microgramas por mililitro.
Transfira um mililitro do estoque para um frasco de cinco mililitros e dilua para volume com acetonitrilo. Em seguida, transfira o estoque para um frasco de vidro âmbar de oito mililitros com uma tampa forrada com PTFE e armazene à temperatura ambiente. Usando um pipettor repetido, prepare os seis estoques adicionais de metil-IPA de 25X descritos no protocolo de texto em oito frascos de vidro âmbar mililitro com tampas alinhadas ao PTFE e armazene à temperatura ambiente.
Para o estoque substituto de 25X, transfira 0,1 mililitro do estoque concentrado de etila-IPA para um frasco volutrico classe A de 10 mililitros usando uma seringa de vidro de 100 microliter e, em seguida, diluir para volume com acetonitrila. Transfira aproximadamente oito mililitros do estoque de substitutos para um frasco de vidro âmbar de oito mililitros com tampa forrada com PTFE e armazene à temperatura ambiente. Transfira o estoque restante para resíduos perigosos.
Em seguida, prepare os estoques 4X contendo tanto methyl-IPA quanto etil-IPA em frascos de amostrador automático de vidro de 10 mililitros, conforme descrito no protocolo de texto. Por exemplo, para preparar o estoque 4X7, adicione 0,2 mililitros do estoque de 25X sete estoques de metil-IPA a um frasco de dois mililitros usando o pipettor repetitivo com uma ponta de capacidade de 0,5 mililitro. Adicione 0,2 mililitros do estoque de 25X etil-IPA substituto usando um pipettor repetido com uma ponta de capacidade de 0,5 mililitro.
Adicione 0,85 mililitros de acetonitrila usando um pipettor repetido com uma ponta de capacidade de mililitro. Tampe o frasco com segurança e inverta cinco vezes para misturar. A seguir, prepare a curva padrão em dois frascos de amostrador automático de rosca mililitro, conforme descrito no protocolo de texto.
Por exemplo, para preparar o padrão sete, adicione 0,2 mililitros do estoque 4X7 a um frasco de dois mililitros, usando um pipettor repetido com uma ponta de capacidade de 0,5 mililitro. Adicione 0,6 mililitros de água ionizada de ultra pureza usando um pipettor repetido com uma ponta de capacidade de mililitro. Tampe os frascos com segurança e inverta cinco vezes para misturar.
Para cada amostra, prepare um tubo de micro centrífuga de 1,5 mililitro contendo 200 a 300 miligramas de cloreto de sódio e disponha os tubos em um rack plástico de 80 posições. Para cada amostra, rotule um tubo de micro centrífuga de 1,5 mililitro como A e um segundo tubo de micro centrífuga como B.Organize os tubos em um rack de plástico de 80 posições. Coloque os seguintes materiais e equipamentos necessários para extração de soro em um armário de biossegurança classe dois: os tubos de micro centrífuga, um misturador de vórtice, um pipettor repetido com 0,5 mililitro e cinco pontas de capacidade mililitro, uma pipeta de deslocamento de ar de 100 a 1000 microlitres com pontas de 1000 microliteres, recipientes com aproximadamente 100 mililitros cada de água diluída e ultra pureza, e recipiente de resíduos de risco biológico.
Em seguida, remova amostras de soro do armazenamento congelado e aqueça até a temperatura ambiente no armário de biossegurança. Misture cada amostra de soro antes da amostragem. Usando um pipettor repetido com uma ponta de capacidade de 0,5 mililitro, distribua 05 mililitros de soro de mangusto no tubo A e adicione 05 mililitros do estoque de substitutos de 25X.
Em seguida, adicione 0,95 mililitros de diluente ao tubo A usando um pipettor repetitivo com uma ponta de capacidade de cinco mililitros. Tampe os tubos com segurança e misture o vórtice por 10 a 15 segundos. Em seguida, adicione o soro de mangusto de controle ao tubo A.Fortify cada uma das amostras de 4QC com me-IPA usando um pipettor repetido com uma ponta de capacidade de 0,5 mililitro.
Adicione 25X de estoque de substituto às amostras de QC. Em seguida, adicione o diluente às amostras de QC. Tampa os tubos e a mistura de vórtice.
Distribua o cloreto de sódio pré-pesado no tubo A e no vórtice de mistura três vezes por oito a 12 segundos. Em seguida, limpe as superfícies externas do frasco contendo tubo A usando isopropanol de 70%. Depois de remover as amostras do armário de biossegurança, o tubo de centrífuga A a 1200 vezes G por um minuto para separar as fases aquosas e acetonitrilos.
Pipeta 0,8 mililitros da fase de acetonitrila superior para o tubo B, usando uma pipeta de deslocamento de ar de 100 a 1000 microlitres. Transfira a solução restante no tubo A para resíduos perigosos e descarte o tubo vazio em um recipiente de resíduos de risco biológico. Agora, remova acetonitrilo e trifluoroacético do tubo B com um fluxo suave de gás nitrogênio em um banho de água de 45 graus Celsius.
Adicione 0,25 mililitros de acetonitrilo ao tubo B usando uma mistura de pipettor e vórtice repetidos por quatro a cinco segundos. Em seguida, centrífuga a 1200 vezes G por dois a quatro segundos para coletar o líquido na parte inferior do tubo. Após a centrifugação, adicione 0,75 mililitros de água deionizada ultra pura ao tubo B usando um pipettor repetido com uma ponta de capacidade de cinco mililitros e mistura de vórtice por quatro a cinco segundos.
Centrifugar a 1200 vezes G por um minuto para esclarecer a amostra. Em seguida, transfira 0,75 mililitros do supernatante para um frasco de amostrador automático usando uma pipeta de deslocamento de ar de 1000 microlitres e descarte as pontas de pipeta no recipiente de resíduos de risco biológico. Limite cada frasco de amostrador automático com segurança para análise de LC-MS/MS.
Transfira a solução restante no tubo B para resíduos perigosos e descarte o tubo vazio em um recipiente de resíduos de risco biológico. Configure o LC-MS/MS com todos os parâmetros descritos no protocolo de texto. Ligue o LC-MS/MS e permita que a coluna atinja 70 graus Celsius antes de definir a taxa de fluxo para 0,8 mililitros por minuto.
Configure uma sequência no software de aquisição de dados para injetar a curva padrão antes e depois de cada lote consistindo de amostras de controle de qualidade e amostras desconhecidas. Injete todas as normas e amostras e adquira cromatogramas de íons mr usando parâmetros listados no protocolo de texto. Após a conclusão da sequência, desligue o LC-MS/MS e descarte todos os frascos de amostrador automático em resíduos perigosos.
O cromatógrama de íon do soro de mangusto de controle ilustra o tempo de retenção da etil-IPA e a ausência de metil-IPA no tempo de retenção indicado. O cromatógrafo de íon da amostra de controle de qualidade ilustra a separação da linha de base do metil-IPA da etíe-IPA, bem como as transições do quantificador e qualificatório para metil-IPA. O cromatógrafo de íon da amostra representativa do estudo mostra uma concentração de soro observada de 33,5 microgramas por microlitera de metila-IPA.
Os resultados de precisão e precisão para controle do soro mangusto fortificado com metil-IPA são mostrados aqui. Percentual de recuperações variou de 96,9 a 109% O desvio percentual nos três níveis de fortificação foi de 3,4%1,7% e 2,3%, respectivamente. Os resultados de precisão e precisão para controle do soro mangusto fortificado com etil-IPA são mostrados aqui.
Percentual de recuperações variou de 89,5 a 115% O desvio padrão percentual nos cinco níveis de fortificação foi de 4,3%1,5%2,3%5,6% e 1,1%, respectivamente. Todas as mangustos ofereciam iscas de etil-IPA e metil-IPA consumiam pelo menos 25% da isca dentro da restrição de tempo de 24 horas e tinham níveis quantificáveis de etil-IPA e metil-IPA em sua soro, respectivamente. A utilidade potencial do método poderia ser aumentada configurando o LC-MS para coletar dados para outros análogos de ácido iofênico, como propil e ácido iofenóxico butil.
Encorajamos o pessoal a consultar as recomendações mais recentes do comitê consultivo sobre práticas de imunização, ou de seu comitê institucional de biossegurança para orientação sobre se a vacinação antirraiva é necessária. As seções 2.3 a 2.6 deste protocolo envolvendo trabalhar com soro não diluído devem ser realizadas em um gabinete de biossegurança classe dois.
