Este protocolo permite a visualização da infecção por vírus e fornece insights profundos sobre a resolução espostetorial do ambiente de infecção e seu contexto celular circundante. A aplicabilidade da imunostenção à imagem de tecido profundo não só permite a detecção de vírus, mas também permite a diferenciação de várias subpopulações celulares usando seus respectivos marcadores celulares. Para corrigir o tecido para imunostaining coloque as amostras cerebrais em uma proporção de 4% de paraformaldeído em PBS para amostrar o volume de tecido por pelo menos 48 horas a quatro graus Celsius.
Ao final do período de fixação lave as amostras de tecido três vezes em PBS por pelo menos 30 minutos por lavagem antes de transferir as amostras para 02% de azida de sódio em PBS a quatro graus Celsius. Em seguida, use um conjunto de vibratome para uma taxa de alimentação de lâmina de 0,3 a 0,5 milímetros por segundo para secionar os tecidos em seções de um milímetro de espessura. Armazene as seções em azida fresca de 02% de sódio na PBS a quatro graus Celsius.
Para o pré-tratamento de metanol, mergulhe as amostras em uma série ascendente de metanol, conforme indicado para uma hora por incubação à temperatura ambiente com oscilação suave. Após a última incubação esfrie as amostras a quatro graus Celsius. Substitua o metanol 100% por quatro mililitros de solução de branqueamento pré-refrigerado para uma incubação durante a noite a quatro graus Celsius.
Na manhã seguinte substitua a solução de branqueamento por quatro mililitros de metanol fresco de 80% para uma incubação de uma hora em temperatura ambiente. Em seguida, mergulhe as amostras em uma série descendente de metanol ao contrário do que foi apenas demonstrado, lavando as amostras uma vez por uma hora em quatro mililitros de PBS após a imersão de 20% de metanol. Para imunostaining das seções de tecido cerebral lavar as amostras duas vezes por uma hora em quatro mililitros de 0,2%Triton X-100 em PBS, seguido de permeabilização por dois dias a 37 graus Celsius em quatro mililitros de 0,2%Triton X-100, 20% sulfoxida de dimetil e 0,3 molar glycine na PBS.
Bloqueie qualquer ligação inespecífica com quatro mililitros de 0,2%Triton X-100, 10% de sulfóxido de dimetil e soro 6% normal em PBS por dois dias a 37 graus Celsius. Ao final da incubação de bloqueio, as amostras com dois mililitros de solução de anticorpos primários durante cinco dias a 37 graus Celsius, refrescando a solução de anticorpos após dois dias e meio. Em seguida, lave as amostras por um dia em quatro mililitros de 0,2%Tween 20 e 10 microgramas por mililitro heparina em PBS trocando o tampão de lavagem pelo menos quatro a cinco vezes durante o dia e deixando a lavagem final durante a noite.
No dia seguinte, incubar as amostras em dois mililitros de solução de anticorpos secundários por cinco dias a 37 graus Celsius. Em seguida, lave as amostras em quatro mililitros de 0,2%Tween 20 e 10 microgramas por heparina mililitro em PBS, como demonstrado. Para coloração nuclear das amostras incubar as amostras em quatro mililitros da mancha de ácido nucleico TO-PRO-3 por cinco horas protegidas da luz.
Ao final da incubação lave as amostras em 0,2%Tween 20 e 10 microgramas por mililitro heparina em PBS como demonstrado, seguido de desidratação em uma série tert-butanol ascendente por duas horas por imersão. Após a imersão de 90%, transfira as amostras para uma solução de 96% tert-butanol durante a noite. Na manhã seguinte, desidrate as amostras ainda mais em 100% tert-butanol por duas horas antes de limpar as seções teciduais em BABB-D15 recém-preparadas por duas a seis horas até que sejam opticamente transparentes.
As amostras podem então ser armazenadas em BABB-D15 protegidas da luz até sua montagem e imagem. Para montagem da amostra use uma impressora 3D para imprimir uma câmara de imagem e uma tampa. Monte uma tampa de 30 milímetros de diâmetro na câmara de imagem com uma temperatura ambiente vulcanizadora de borracha de silicone.
Da mesma forma, monte uma tampa de 22 milímetros na tampa. Use um cotonete de algodão molhado à água para remover o excesso de borracha de silicone em ambos os anéis antes de permitir que a borracha cure durante a noite. No dia seguinte, coloque uma amostra na câmara de imagem e adicione um pequeno volume de BABB-D15 à câmara antes de inserir a tampa.
Usando uma agulha hipodérmica encha a câmara com BABB-D15 através da entrada e conecte a entrada antes de selar a câmara de imagem com borracha de silicone. Para configurar a aquisição de imagens selecione as linhas laser apropriadas para os fluoroforos utilizados e ajuste as faixas de detecção de cada detector para evitar a sobreposição de sinal entre os canais. Em seguida, defina os parâmetros de aquisição para encontrar a borda superior e inferior da pilha Z e adquirir a pilha de imagens.
Para gerar projeções 3D da pilha de imagens, abra os arquivos de imagem em Fiji e selecione Image Color Channels Tool Mais e Split Channels para dividir as imagens mescladas em canais individuais. Para correção alvejante das imagens, para cada canal selecione Correção de Alvejante de Ajuste de imagem e selecione Razão Simples. Use os controles deslizantes para ajustar o brilho e o contraste para cada canal e selecione Os canais de cor de imagem e mesclagem.
Marque a opção Criar composto. Converta a imagem em formato RGB e selecione Pilhas de Imagens e Projeto 3D para gerar uma projeção 3D. Selecione Brightest Point como o método De projeção e defina o espaçamento de fatias para corresponder ao tamanho da etapa Z da pilha de imagens adquirida.
Para uma qualidade máxima, defina o incremento do ângulo de rotação para um e habilite a Interpolação. Modifique a rotação total, os limites de transparência e a Opacidade conforme necessário. Em seguida, salve a projeção 3D como formatos de arquivos Tiff e AVI.
O uso de imunossuagem de vírus da raiva, camadas complexas de células neuronais infectadas podem ser visualizadas em seções grossas de amostras de tecido cerebral do camundongo. Posteriormente, projeções 3D perfeitas das pilhas de imagens adquiridas podem ser reconstruídas. Devido à alta resolução com que as pilhas de imagem são adquiridas, a infecção pode ser avaliada até um único nível celular, permitindo afirmações sobre, por exemplo, a abundância e distribuição de antígeno dentro de uma célula de interesse.
Além do tecido cerebral do camundongo, o protocolo pode ser aplicado a amostras de tecido cerebral de outras espécies animais. Por exemplo, seções obtidas de diferentes compartimentos de um cérebro de furão infectado revelam um grau variado de infecção por vírus da raiva. Os astrócitos podem ser diferenciados através da expressão da proteína ácida fibrilar glial, enquanto os neurites podem ser especificamente manchados para proteína associada a microtúbulos II.Simultaneamente, as proteínas virais podem ser co-manchadas para avaliar a relação entre as células infectadas e a subpopulação celular destacada.
Para imunosterar a escolha de anticorpos para detectar as proteínas de interesse é crucial. Embora as concentrações de imunohistoquímica padrão sejam frequentemente um bom ponto de partida, alguns anticorpos podem precisar de ajuste adicional. Muitos dos produtos químicos usados neste protocolo têm propriedades prejudiciais.
Realize o respectivo experimento em um capuz de fumaça usando equipamentos de proteção pessoal apropriados, incluindo um jaleco e luvas.
