Bu protokol virüs enfeksiyonunun görselleştirilmesini sağlar ve enfeksiyon ortamının ve çevresindeki hücresel bağlamın spatiotemporal çözünürlüğü hakkında derin bilgiler sağlar. İmmünlemesi derin doku görüntülemesine uygulanabilirliği sadece virüslerin saptanmasına izin vermekle kalmıyor, aynı zamanda kendi hücre belirteçlerini kullanarak çeşitli hücresel alt popülasyonların farklılaşmasını da sağlar. İmmünoboyama için doku düzeltmek için pbs% 4 paraformaldehit bir 1-10 oranı beyin örnekleri yer doku hacmi en az 48 saat boyunca dört santigrat derece doku hacmi.
Fiksasyon döneminin sonunda doku örneklerini yıkama başına en az 30 dakika boyunca pbs'de üç kez yıkayın ve numuneleri Dört santigrat derecede PBS'de %02 sodyum azite aktarın. Daha sonra dokuları bir milimetre kalınlığında bölümlere böldürmek için saniyede 0,3 ila 0,5 milimetrelik bir vibratom kullanın. PBS'de taze %02 sodyum azitte dört santigrat derecede saklayın.
Metanol ön işleme için nazik salınım ile oda sıcaklığında kuluçka başına bir saat için belirtildiği gibi artan bir metanol serisi örnekleri batırın. Son kuluçkadan sonra numuneleri 4 dereceye kadar soğutun. Dört santigrat derecede bir gecede kuluçka için önceden soğutulmuş ağartma çözeltisi dört mililitre ile% 100 metanol değiştirin.
Ertesi sabah oda sıcaklığında bir saat kuluçka için taze% 80 metanol dört mililitre ile beyazlatma çözeltisi değiştirin. Daha sonra örnekleri az önce gösterilenin tersi bir metanol serisine batırın, %20 metanol daldırmadan sonra dört mililitre PBS'de bir saat boyunca numuneleri yıkanın. Beyin dokusu bölümlerinin immünboyama için pbs 0.2% Triton X-100 dört mililitre bir saat için iki kez örnekleri yıkayın, pbs% 0.2 Triton X-100 dört mililitre 37 derece santigrat iki gün geçirgenleştirme izledi, 20% dimethyl sulfoxide, ve PBS 0.3 molar glisin.
%0.2 Triton X-100, %10 dimetil sülfoksit ve PBS'de %6 normal serum olmak üzere dört mililitre 37 santigrat derece ile nonspesifik bağlanmayı engelleyin. Bloke kuluçka etiketinin sonunda, 37 santigrat derecede beş gün boyunca iki mililitre primer antikor solüsyonu içeren numuneler, iki ve 1/2 gün sonra antikor solüsyonunu yeniler. Daha sonra, pbs mililitre heparin başına mililitre dört mililitre bir gün için yıkayın en az dört ila beş kez gün boyunca yıkama tampon alışverişi ve gece boyunca son yıkama bırakarak.
Ertesi gün, örnekleri iki mililitre ikincil antikor solüsyonu yla 5 gün boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Daha sonra pbs yılında mililitre heparin başına taze 0.2% Tween 20 ve 10 mikrogram dört mililitre yıkama. Numunelerin nükleer boyama için numuneler, ışıktan korunan beş saat boyunca TO-PRO-3 nükleik asit lekesi TO-PRO-3'ün dört mililitresinde kuluçkaya yatırın.
Kuluçka sonunda, numuneleri pbs'de mililitre heparin başına %0,2'lik Tween 20 ve 10 mikrogram halinde yıkayın ve ardından daldırma başına iki saat boyunca yükselen tert-butanol serisinde dehidratasyon takip edin. %90 daldırma dan sonra numuneler bir gecede %96 tert-butanol çözeltisine aktarın. Ertesi sabah, optik saydam olana kadar iki ila altı saat boyunca taze hazırlanmış BABB-D15 doku bölümleri temizlemeden önce iki saat boyunca% 100 tert-butanol daha fazla örnekleri dehydrate.
Numuneler daha sonra babb-D15'te ışıktan monte ve görüntülemeye kadar korunmaktadır. Örnek montaj için bir görüntüleme odası ve kapak yazdırmak için bir 3D yazıcı kullanın. Tek bileşenli oda sıcaklığında vulkanize silikon kauçuk ile görüntüleme odasına 30 milimetre çapında bir kapak kapağı monte.
Benzer şekilde, kapağın üzerine 22 milimetrelik bir kapak kaydırın. Kauçuğun bir gecede tedavi etmesine izin vermeden önce her iki halkadaki fazla silikon kauçuğu çıkarmak için suyla ıslanmış pamuklu bir bez kullanın. Ertesi gün, görüntüleme odasına bir örnek yerleştirin ve kapağı takmadan önce hazneye küçük bir hacim BABB-D15 ekleyin.
Hipodermik bir iğne kullanarak giriş yoluyla BABB-D15 ile hazne doldurun ve silikon kauçuk ile görüntüleme odası mühürleme önce giriş takın. Görüntü edinimini ayarlamak için kullanılan floroforlar için uygun lazer çizgilerini seçin ve kanallar arasında sinyalin çakışmasını önlemek için her dedektörün algılama aralıklarını ayarlayın. Ardından, Z yığınının üst ve alt kenarlığı bulmak ve görüntü yığınını elde etmek için edinme parametrelerini ayarlayın.
Görüntü yığınının 3B projeksiyonlarını oluşturmak için Fiji'deki görüntü dosyalarını açın ve birleştirilen görüntüleri tek tek kanallara bölmek için Görüntü Renk Kanalları Aracı Daha Fazla ve Bölünmüş Kanallar'ı seçin. Görüntülerin beyazlatıcı düzeltmesi için, her kanal için Görüntü Ayar Beyazlatıcı Düzeltme'yi seçin ve Basit Oran'ı seçin. Her kanalın parlaklığını ve kontrastını ayarlamak için kaydırıcıları kullanın ve Görüntü Rengi ve Birleştirme Kanalları'nı seçin.
Bileşik oluştur seçeneğini işaretleyin. Görüntüyü RGB biçimine dönüştürün ve 3B projeksiyon oluşturmak için Görüntü Yığınları ve 3B Project'i seçin. Projeksiyon yöntemi olarak En Parlak Nokta'yı seçin ve alınan görüntü yığınının Z adımı boyutuyla eşleşecek şekilde dilim aralığını ayarlayın.
Maksimum kalite için Dönüş açısını bire ayarlayın ve Enterpolasyon'u etkinleştirin. Gerektiğinde Toplam döndürmeyi, saydamlık eşiklerini ve Opaklığı değiştirin. Ardından 3B projeksiyonu hem tiff hem de AVI dosya biçimleri olarak kaydedin.
Enfekte nöronal hücrelerin kuduz virüsü fosfoprotein kompleks tabakalarının immünboyama kullanarak fare beyin dokusu örneklerikalın bölümlerinde görselleştirilmiş olabilir. Daha sonra, edinilen görüntü yığınlarının sorunsuz 3B projeksiyonları yeniden oluşturulabilir. Görüntü yığınlarının edinildiği yüksek çözünürlük nedeniyle, enfeksiyon tek bir hücre düzeyine kadar değerlendirilebilir ve örneğin, bir ilgi hücresi içinde antijenin bolluğu ve dağıtımı hakkında iddialara izin verir.
Protokol, fare beyin dokusuna ek olarak diğer hayvan türlerinden alınan beyin dokusu örneklerine de uygulanabilir. Örneğin, enfekte gelincik beyninin farklı bölmelerinden elde edilen bölümler kuduz virüsü enfeksiyonunun değişen derecelerde ortaya koymaktadır. Astrositler glial fibrillary asit proteininin ekspresyonu ile ayırt edilebilirken, nöritler mikrotübül ilişkili protein II.Eş zamanlı olarak, viral proteinler enfekte hücreler ile vurgulanan hücresel alt popülasyon arasındaki ilişkiyi değerlendirmek için eşlenebilir.
Immünostaining için antikorların seçimi ilgi proteinleri tespit etmek için çok önemlidir. Standart immünohistokimya konsantrasyonları genellikle iyi bir başlangıç noktası olmakla birlikte, bazı antikorların ek ayarlamaya ihtiyacı olabilir. Bu protokolde kullanılan kimyasalların çoğu zararlı özelliklere sahiptir.
Bir laboratuvar önlüğü ve eldiven de dahil olmak üzere uygun kişisel koruyucu ekipman giyen bir duman başlık ilgili deney yürütmek.
