Ce protocole permet la visualisation de l’infection virale et fournit des aperçus profonds de la résolution spatiotemporale de l’environnement de l’infection et de son contexte cellulaire environnant. L’applicabilité de l’immunostaining à l’imagerie tissulaire profonde permet non seulement la détection de virus, mais permet en fait également la différenciation de diverses sous-populations cellulaires à l’aide de leurs marqueurs cellulaires respectifs. Pour fixer le tissu pour l’immunostaining placer les échantillons de cerveau dans un rapport un à 10 de 4%paraformaldéhyde dans PBS pour échantillonner le volume de tissu pendant au moins 48 heures à quatre degrés Celsius.
À la fin de la période de fixation, laver les échantillons de tissus trois fois dans le PBS pendant au moins 30 minutes par lavage avant de transférer les échantillons à 02 % d’azide de sodium dans le PBS à quatre degrés Celsius. Ensuite, utilisez un vibratome réglé à un taux d’alimentation de 0,3 à 0,5 millimètre par seconde pour sectioner les tissus en sections d’un millimètre d’épaisseur. Conservez les sections dans de l’azide de sodium frais à 02 % en PBS à quatre degrés Celsius.
Pour le prétraitement au méthanol, plongez les échantillons dans une série ascendante de méthanol comme indiqué pendant une heure par incubation à température ambiante avec oscillation douce. Après la dernière incubation refroidir les échantillons à quatre degrés Celsius. Remplacez le 100% méthanol par quatre millilitres de solution de blanchiment pré-réfrigérée pour une incubation d’une nuit à quatre degrés Celsius.
Le lendemain matin, remplacez la solution de blanchiment par quatre millilitres de méthanol frais à 80 % pour une incubation d’une heure à température ambiante. Puis immerger les échantillons dans une série descendante de méthanol à l’envers de ce qui vient d’être démontré, laver les échantillons une fois pendant une heure en quatre millilitres de PBS après l’immersion de 20% de méthanol. Pour l’immunostaining des sections de tissu de cerveau lavent les échantillons deux fois pendant une heure dans quatre millilitres de 0.2%Triton X-100 dans PBS, suivi de la permeabilization pendant deux jours à 37 degrés Celsius dans quatre millilitres de 0.2%Triton X-100, 20% sulfoxyde de diméthyle, et 0.3 glycine molaire dans PBS.
Bloquez toute liaison non spécifique avec quatre millilitres de 0,2% Triton X-100, 10% de sulfoxyde de diméthyle, et 6% sérum normal dans PBS pendant deux jours à 37 degrés Celsius. À la fin de l’étiquette d’incubation de blocage, les échantillons avec deux millilitres de solution primaire d’anticorps pendant cinq jours à 37 degrés Celsius, rafraîchissant la solution d’anticorps après deux jours et demi. Ensuite, lavez les échantillons pendant une journée en quatre millilitres de 0,2 %Tween 20 et 10 microgrammes par millilitre d’héparine dans pbs échangeant le tampon de lavage au moins quatre à cinq fois au cours de la journée et laissant le lavage final pendant la nuit.
Le lendemain, incuber les échantillons en deux millilitres de solution d’anticorps secondaire pendant cinq jours à 37 degrés Celsius. Ensuite, lavez les échantillons en quatre millilitres de 0,2 % de tween frais 20 et de 10 microgrammes par héparine millilitre dans le PBS, comme démontré. Pour la coloration nucléaire des échantillons, incuber les échantillons en quatre millilitres de la tache d’acide nucléique TO-PRO-3 pendant cinq heures à l’abri de la lumière.
À la fin de l’incubation laver les échantillons dans 0,2%Tween 20 et 10 microgrammes par millilitre héparine dans PBS comme démontré, suivie par la déshydratation dans une série ascendante tert-butanol pendant deux heures par immersion. Après l’immersion de 90%, transférez les échantillons à une solution 96% tert-butanol du jour au lendemain. Le lendemain matin, déshydratez les échantillons plus loin dans 100% tert-butanol pendant deux heures avant de dégager les sections tissulaires dans babb-D15 fraîchement préparé pendant deux à six heures jusqu’à ce qu’ils soient optiquement transparents.
Les échantillons peuvent ensuite être stockés dans BABB-D15 protégés de la lumière jusqu’à leur montage et leur imagerie. Pour le montage d’échantillons, utilisez une imprimante 3D pour imprimer une chambre d’imagerie et un couvercle. Montez un couvercle de 30 millimètres de diamètre sur la chambre d’imagerie avec du caoutchouc de silicone vulcanisant à température ambiante à un composant.
De même, montez un couvercle de 22 millimètres sur le couvercle. Utilisez un coton-tige mouillé à l’eau pour enlever l’excès de caoutchouc de silicone sur les deux anneaux avant de permettre au caoutchouc de guérir pendant la nuit. Le lendemain, placez un échantillon dans la chambre d’imagerie et ajoutez un petit volume de BABB-D15 à la chambre avant d’insérer le couvercle.
À l’aide d’une aiguille hypodermique, remplir la chambre de BABB-D15 à travers l’entrée et boucher l’entrée avant de sceller la chambre d’imagerie avec du caoutchouc silicone. Pour configurer l’acquisition de l’image, sélectionnez les lignes laser appropriées pour les fluorophores utilisés et ajustez les plages de détection de chaque détecteur afin d’éviter le chevauchement des signaux entre les canaux. Définissez ensuite les paramètres d’acquisition pour trouver la bordure supérieure et inférieure de la pile Z et acquérir la pile d’images.
Pour générer des projections 3D de la pile d’images ouvrez les fichiers d’image aux Fidji et sélectionnez Image Color Channels Tool More et Split Channels pour diviser les images fusionnées en canaux individuels. Pour la correction de l’eau de Javel des images, pour chaque canal sélectionnez Image Adjust Bleach Correction et sélectionnez Simple Ratio. Utilisez les curseurs pour ajuster la luminosité et le contraste de chaque canal, et sélectionnez la couleur d’image et les canaux de fusion.
Cochez l’option Créer composite. Convertissez l’image en format RVB et sélectionnez Piles d’images et projet 3D pour générer une projection 3D. Sélectionnez Brightest Point comme méthode de projection et réglez l’espacement des tranches pour correspondre à la taille z-step de la pile d’images acquise.
Pour une qualité maximale, définissez l’incrément d’angle de rotation à un seul et activez Interpolation. Modifiez la rotation totale, les seuils de transparence et l’opacité au besoin. Enregistrez ensuite la projection 3D sous forme de formats de fichiers tiff et AVI.
L’utilisation de l’immunostaining des couches complexes de phosphoprotéine de virus de rage des cellules neuronales infectées peut être visualisée dans les sections épaisses des échantillons de tissu de cerveau de souris. Par la suite, des projections 3D transparentes des piles d’images acquises peuvent être reconstruites. En raison de la haute résolution avec laquelle les piles d’images sont acquises, l’infection peut être évaluée jusqu’à un seul niveau de cellule, permettant des affirmations sur, par exemple, l’abondance et la distribution de l’antigène au sein d’une cellule d’intérêt.
En plus du tissu cérébral de souris, le protocole peut être appliqué aux échantillons de tissu cérébral d’autres espèces animales. Par exemple, les sections obtenues à partir de différents compartiments d’un cerveau de furet infecté révèlent un degré variable d’infection par le virus de la rage. Les astrocytes peuvent être différenciés par l’expression de la protéine acide fibrillaire gliale tandis que les neurites peuvent être spécifiquement souillés pour la protéine II.Simultaneously microtubule-associée, les protéines virales peuvent être co-souillées pour évaluer la relation entre les cellules infectées et la sous-population cellulaire mise en évidence.
Pour l’immunostaining le choix des anticorps pour détecter les protéines d’intérêt est crucial. Alors que les concentrations standard d’immunohistochimie sont souvent un bon point de départ, certains anticorps peuvent avoir besoin d’ajustement supplémentaire. Bon nombre des produits chimiques utilisés dans ce protocole ont des propriétés nocives.
Mener l’expérience respective dans une hotte à fumée portant l’équipement de protection individuelle approprié, y compris un manteau de laboratoire et des gants.
