이 프로토콜은 바이러스 감염의 시각화를 가능하게하고 감염 환경과 그 주변 세포 맥락의 현면 적 해결에 깊은 통찰력을 제공합니다. 심층 조직 이미징에 면역 스테인링의 적용성은 바이러스의 검출을 허용할 뿐만 아니라, 실제로는 각각의 세포 마커를 사용하여 다양한 세포 하위 집단의 분화를 가능하게 합니다. 면역 염색을 위한 조직을 고치기 위하여는 4섭씨에서 적어도 48 시간 동안 조직 부피를 샘플링하기 위하여 PBS에 있는 4%paraformaldehyde의 1 1 10 비율에 두뇌 견본을 두는.
고정 기간이 끝나면 PBS에서 3회 이상 세척한 후 4°C에서 PBS에서 02%의 나트륨 아지드로 샘플을 이송한다. 그런 다음 초당 0.3 ~ 0.5 밀리미터로 설정된 진동체를 사용하여 조직을 1밀리미터 두께의 섹션으로 섹션화합니다. PBS에서 신선한 02% 나트륨 아지드에 섹션을 섭씨 4도에 저장합니다.
메탄올 전처리를 위해 부드러운 진동으로 실내 온도에서 인큐베이션 당 1 시간 동안 표시된 대로 오름차순 메탄올 시리즈에 샘플을 담그면 됩니다. 마지막 인큐베이션 후 샘플을 섭씨 4도로 냉각시합니다. 100% 메탄올을 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 잠식할 수 있도록 미리 냉각된 표백 용액 4밀리리터로 교체하십시오.
다음날 아침 표백 액액을 실온에서 1시간 동안 신선한 80%메탄올 4밀리리터로 대체합니다. 그런 다음 방금 시연된 메탄올의 내림차순 에 샘플을 담그고, 20%의 메탄올 침수 후 PBS의 4밀리리터에서 1시간 동안 샘플을 한 번 세척합니다. 뇌조직 섹션의 면역염색을 위해 PBS에서 0.2%트리톤 X-100의 4밀리리터에서 1시간 동안 샘플을 2회 세척하고, 2일간 37도에서 37도의 투과를 4밀리리터에서 0.2%트리톤 X-100, 20%디메틸 황산화물, 0.3°C의 글리티로 세척한다.
섭씨 37도에서 2일 동안 PBS에서 0.2%트리톤 X-100, 10%디메틸 설프리산화물, 6%의 일반 혈청으로 비특이적 결합을 차단합니다. 차단 인큐베이션의 끝에서 37섭씨에서 5일 동안 2밀리리터의 1차 항체 용액을 가진 시료를 2일 및 1/2일 후에 상쾌하게 한다. 다음으로, PBS에서 밀리리터 헤파린 당 0.2%Tween 20 및 10 마이크로그램의 4밀리리터로 하루 동안 샘플을 세척하여 하루 중 적어도 4~5회 세척 버퍼를 교환하고 밤새 최종 세척을 종료합니다.
다음 날, 37섭씨에서 5일간 이차 항체 용액의 2밀리리터로 샘플을 배양한다. 그런 다음 PBS에서 밀리리터 헤파린 당 신선한 0.2%Tween 20 및 10 마이크로그램의 4밀리리터에서 샘플을 세척합니다. 시료의 핵 염색을 위해 빛으로부터 보호되는 5시간 동안 핵산 얼룩 TO-PRO-3의 4밀리리터에서 샘플을 배양한다.
인큐베이션의 끝에서 PBS에서 밀리리터 헤파린 당 0.2%Tween 20 및 10 마이크로그램으로 샘플을 세척하고, 침지당 2시간 동안 오름차순 터트 부타놀 시리즈에서 탈수상태가 뒤따랐다. 90%의 침수 후 샘플을 하룻밤 동안 96% tert-butanol 용액으로 옮길 수 있습니다. 다음 아침, 샘플을 100% tert-butanol에서 2시간 동안 더 탈수한 후, 신선하게 준비된 BABB-D15의 조직 섹션을 광학적으로 투명해질 때까지 2~6시간 동안 제거합니다.
그런 다음 샘플은 장착 및 이미징까지 빛으로부터 보호되는 BABB-D15에 저장할 수 있습니다. 샘플 마운팅의 경우 3D 프린터를 사용하여 이미징 챔버와 뚜껑을 인쇄합니다. 30mm 직경의 커버슬립을 이미징 챔버에 장착하여 1성분 실온을 가압하는 실리콘 고무를 장착합니다.
마찬가지로 뚜껑에 22mm 커버슬립을 장착합니다. 물에 젖은 면봉을 사용하여 두 링의 과도한 실리콘 고무를 제거한 후 고무가 하룻밤 동안 치료할 수 있도록 합니다. 다음 날, 이미징 챔버에 샘플을 놓고 뚜껑을 삽입하기 전에 챔버에 소량의 BABB-D15를 추가합니다.
피하 바늘을 사용하여 입구를 통해 BABB-D15로 챔버를 채우고 실리콘 고무로 이미징 챔버를 밀봉하기 전에 입구를 연결합니다. 이미지 수집을 설정하려면 사용되는 형광에 적합한 레이저 라인을 선택하고 각 검출기의 검출 범위를 조정하여 채널 간의 신호 중첩을 방지합니다. 그런 다음 획득 매개 변수를 설정하여 Z 스택의 상하 경계를 찾아 이미지 스택을 획득합니다.
이미지 스택의 3D 프로젝션을 생성하려면 피지의 이미지 파일을 열고 이미지 컬러 채널 도구 자세히 선택하고 채널을 분할하여 병합된 이미지를 개별 채널로 분할합니다. 이미지의 표백제 보정을 위해 각 채널에 대해 이미지 조정 표백제 보정을 선택하고 간단한 비율을 선택합니다. 슬라이더를 사용하여 각 채널의 밝기와 대비를 조정하고 이미지 색상 및 병합 채널을 선택합니다.
옵션을 선택합니다 합성 만들기. 이미지를 RGB 형식으로 변환하고 이미지 스택 및 3D 프로젝트를 선택하여 3D 프로젝션을 생성합니다. 가장 밝은 점을 프로젝션 메서드로 선택하고 획득한 이미지 스택의 Z 단계 크기에 맞게 슬라이스 간격을 설정합니다.
최대 품질의 경우 회전 각도를 하나로 설정하고 보간을 활성화합니다. 필요에 따라 총 회전, 투명도 임계값 및 불투명도를 수정합니다. 그런 다음 3D 프로젝션을 티프 및 AVI 파일 형식으로 저장합니다.
광견병 바이러스 인포단백질 복합층의 면역염색을 사용하여 마우스 뇌 조직 샘플의 두꺼운 섹션에서 시각화할 수 있다. 그 후 획득된 이미지 스택의 원활한 3D 프로젝션을 재구성할 수 있습니다. 이미지 스택이 획득되는 고해상도 때문에, 감염은 단일 세포 수준까지 평가될 수 있으며, 예를 들어 관심 있는 세포 내의 항원의 풍부하고 분포에 대한 주장을 허용한다.
마우스 뇌 조직 이외에, 프로토콜은 다른 동물 종의 뇌 조직 샘플에 적용 될 수있다. 예를 들면, 감염된 페렛 두뇌의 다른 구획에서 얻은 단면도광견 바이러스 감염의 다양한 정도를 드러냅니다. 성상세포는 신경교 섬유산 단백질의 발현을 통해 분화될 수 있으며, 중성염은 마이크로튜버-관련 단백질 II.동시에, 바이러스 성 단백질은 감염된 세포와 강조된 세포 하위 집단 사이의 관계를 평가하기 위해 공동 염색될 수 있다.
관심 있는 단백질을 검출하기 위하여 항체의 선택을 면역 염색하는 것은 중요합니다. 표준 면역 히스토화학 농도는 종종 좋은 출발점이지만 일부 항체는 추가 조정이 필요할 수 있습니다. 이 프로토콜에 사용되는 화학 물질의 대부분은 유해한 특성을 가지고 있습니다.
실험실 코트와 장갑을 포함한 적절한 개인 보호 장비를 착용 연기 후드에서 각각의 실험을 수행합니다.
