פרוטוקול זה מאפשר הדמיה של הידבקות בנגיף ומספק תובנות עמוקות על הרזולוציה המרחבית של סביבת הזיהום וההקשר התאי הסובב אותה. ההיישום של כשל חיסוני להדמיית רקמות עמוקות לא רק מאפשר זיהוי של וירוסים, אלא למעשה גם מאפשר התביור של תת-כפילויות תאיות שונות באמצעות סמני התאים המתאימים להן. כדי לתקן את הרקמה עבור immunostaining למקם את דגימות המוח ביחס של 1 עד 10 של 4% paraformaldehyde ב PBS כדי לדגום נפח רקמות לפחות 48 שעות בארבע מעלות צלזיוס.
בסוף תקופת התקבעון לשטוף את דגימות הרקמה שלוש פעמים PBS לפחות 30 דקות לשטוף לפני העברת הדגימות 02% נתרן אזיד ב PBS בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן השתמש ברטט שנקבע לקצב הזנת להב של 0.3 עד 0.5 מילימטרים לשנייה כדי לחלק את הרקמות לחלקים בעובי של מילימטר אחד. אחסנו את החלקים ב-02% נתרן אזיד טרי ב-PBS בארבע מעלות צלזיוס.
עבור טיפול מקדים מתנול לטבול את הדגימות בסדרה מתנול עולה כפי שצוין במשך שעה אחת לכל דגירה בטמפרטורת החדר עם תנודות עדינות. לאחר הדגירה האחרונה לקרר את הדגימות לארבע מעלות צלזיוס. החליפו את ה-100% מתנול בארבעה מיליליטר של תותב הלבנה מקורר מראש עבור דגירה של לילה בארבע מעלות צלזיוס.
למחרת בבוקר תחליף את תסכולת ההלבנה בארבעה מיליליטר של מתנול טרי של 80% עבור דגירה של שעה בטמפרטורת החדר. ואז לטבול את הדגימות בסדרה יורדת של מתנול הפוך של מה שהוכח רק, לשטוף את הדגימות פעם אחת במשך שעה אחת בארבעה מיליליטר של PBS לאחר טבילה 20% מתנול. לכשל חיסוני של חלקי רקמת המוח לשטוף את הדגימות פעמיים במשך שעה אחת בארבעה מיליליטר של 0.2% טריטון X-100 ב PBS, ואחריו permeabilization במשך יומיים ב 37 מעלות צלזיוס בארבעה מיליליטר של 0.2% טריטון X-100, 20% dimethyl sulfoxide, ו 0.3
חסום כל כריכה לא ספציפית עם ארבעה מיליליטר של 0.2% טריטון X-100, 10%dimethyl sulfoxide, ו 6% סרום נורמלי PBS במשך יומיים ב 37 מעלות צלזיוס. בסוף דגירה חסימה תווית הדגימות עם שני מיליליטר של פתרון נוגדנים ראשוני במשך חמישה ימים ב 37 מעלות צלזיוס, רענון פתרון הנוגדן לאחר יומיים וחצי. לאחר מכן, לשטוף את הדגימות ליום אחד בארבעה מיליליטר של 0.2%Tween 20 ו 10 מיקרוגרם לכל הפרין מיליליטר ב PBS החלפת מאגר לשטוף לפחות ארבע עד חמש פעמים במהלך היום ולהשאיר את הכביסה הסופית על לילה.
למחרת, להדגיר את הדגימות בשני מיליליטר של פתרון נוגדנים משני במשך חמישה ימים ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן לשטוף את הדגימות בארבעה מיליליטר של טרי 0.2%Tween 20 ו 10 מיקרוגרם לכל הפרין מיליליטר ב PBS כפי שהוכח. עבור כתמים גרעיניים של הדגימות להדגיר את הדגימות בארבעה מיליליטר של כתם חומצת הגרעין TO-PRO-3 במשך חמש שעות מוגן מפני אור.
בסוף הדגירה לשטוף את הדגימות ב 0.2% Tween 20 ו 10 מיקרוגרם לכל הפרין מיליליטר ב PBS כפי שהוכח, ואחריו התייבשות בסדרה עולה tert-butanol במשך שעתיים לטבילה. לאחר טבילה 90%להעביר את הדגימות 96%tert-butanol פתרון לילה. למחרת בבוקר, לייבש את הדגימות עוד יותר ב 100% tert-butanol במשך שעתיים לפני ניקוי חלקי הרקמה ב BABB-D15 מוכן טרי במשך שעתיים עד שש שעות עד שהם שקופים אופטית.
לאחר מכן ניתן לאחסן את הדגימות ב BABB-D15 מוגן מפני אור עד הרכבה והדמיה שלהם. להרכבה לדוגמה, השתמש במדפסת תלת-ממד להדפסת תא דימות ומכסה. הר קוטר של 30 מילימטר מכסה על תא ההדמיה עם טמפרטורת חדר של רכיב אחד וולקניזציה גומי סיליקון.
באופן דומה, הר כיסוי 22 מילימטר על המכסה. השתמש ספוגית כותנה רטובה במים כדי להסיר את גומי סיליקון עודף על שתי הטבעות לפני המאפשר גומי לרפא בן לילה. למחרת, מניחים דגימה בתא ההדמיה ומוסיפים נפח קטן של BABB-D15 לתא לפני החדרת המכסה.
באמצעות מחט hypodermic למלא את התא עם BABB-D15 דרך inlet ולחבר את inlet לפני איטום תא ההדמיה עם גומי סיליקון. כדי להגדיר את רכישת התמונה בחר את קווי הלייזר המתאימים עבור הפלואורופורים המשמשים, והתאם את טווחי הזיהוי של כל גלאי כדי למנוע חפיפה בין ערוצים. לאחר מכן הגדר את פרמטרי הרכישה כדי למצוא את הגבול העליון והתחתון של מחסנית Z ולרכוש את מחסנית התמונות.
ליצירת הקרנות תלת-מימדיות של ערימת התמונות, פתחו את קובצי התמונה בפיג'י ובחרו 'כלי ערוצי צבע תמונה עוד' ו'פיצול ערוצים' כדי לפצל את התמונות הממוזגות לערוצים בודדים. לתיקון אקונומיקה של התמונות, לכל ערוץ בחרו 'התאמת תמונה לתיקון אקונומיקה' ובחרו 'יחס פשוט'. השתמשו במ המחוונים להתאמת הבהירות והניגודיות של כל ערוץ, ובחרו 'צבע תמונה' ו'מזג ערוצים'.
סמן את האפשרות צור ללא הפרדות צבע. המירו את התמונה לתבנית RGB ובחרו 'ערימות תמונה' ו'פרוייקט תלת-מימדי' ליצירת הקרנה תלת-מימדית. בחרו 'הנקודה הבהירה ביותר' כשיטה 'הקרנה' והגדירו את מרווח הפרוסה כך שיתאימו לגודל שלב Z של מחסנית התמונה שנרכשה.
לקבלת איכות מרבית, הגדר את תוספת זווית הסיבוב לאחת והפוך את האינטרפולציה לזמינה. שנה את הסיבוב הכולל, את ספי השקיפות ואת האטימות לפי הצורך. לאחר מכן שמרו את ההקרנה תלת-מימדית הן בתבניות קובץ tiff והן בתבניות קובץ AVI.
באמצעות immunostaining של וירוס כלבת phosphoprotein שכבות מורכבות של תאים עצביים נגועים ניתן לדמיין בחלקים עבים של דגימות רקמת המוח של העכבר. לאחר מכן, ניתן לשחזר הקרנות תלת-מימד חלקות של ערימות התמונות שנרכשו. בגלל הרזולוציה הגבוהה שבה ערימות התמונה נרכשות, ניתן להעריך את הזיהום עד לרמת תא יחיד, המאפשרת קביעות על, למשל, שפע והפצה של אנטיגן בתוך תא מעניין.
בנוסף לרקמת המוח של העכבר, ניתן ליישם את הפרוטוקול על דגימות רקמת מוח ממין אחר של בעלי חיים. לדוגמה, קטעים המתקבלים מתאים שונים של מוח חמוס נגוע חושפים דרגה משתנה של זיהום בנגיף הכלבת. אסטרוציטים ניתן להבדיל באמצעות ביטוי של חלבון חומצה פוליברילית גליה בעוד neurites יכול להיות מוכתם במיוחד עבור חלבון הקשורים microtubule II.בו זמנית, חלבונים ויראליים יכולים להיות מוכתמים במשותף כדי להעריך את הקשר בין התאים הנגועים ואת subpopulation הסלולר מודגש.
עבור immunostaining הבחירה של נוגדנים כדי לזהות את החלבונים של עניין הוא חיוני. בעוד ריכוזי אימונוהיסטוכימיה סטנדרטיים הם לעתים קרובות נקודת התחלה טובה, נוגדנים מסוימים עשויים להזדקק להתאמה נוספת. רבים מהכימיקלים המשמשים בפרוטוקול זה יש תכונות מזיקות.
לנהל את הניסוי בהתאמה ברדס אדים לובש ציוד מגן אישי מתאים כולל חלוק מעבדה וכפפות.
