Este protocolo descreve a síntese de um sistema de nanopartículas que é capaz de silenciar genes in vivo, fornecendo siRNAs com alta eficiência. Ao simplesmente trocar o peptídeo direcionado e a carga de siRNA, as nanopartículas fusogênicas podem ser usadas como uma formulação terapêutica potencial para doenças que requerem modulação genética in vivo. Publicamos resultados anteriormente usando a nanoplataforma fusogênica contra infecções bacterianas gram-positivas silenciando um gene que codifica para inflamação em macrófagos para acabar com a inflamação crônica.
Antes de realizar este procedimento, monte uma célula de etch Teflon contendo um wafer de silício em uma solução de ácido fluorídrico de três para um. Execute uma corrente alternada de uma posição de onda quadrada com uma baixa densidade de corrente de 50 miliamperes por centímetro quadrado por 0,6 segundos e uma alta densidade de corrente de 400 miliamperes por centímetro quadrado por 0,36 segundos repetida por 500 ciclos. Uma vez que a gravação esteja terminada, remova a célula do circuito e enxágue cuidadosamente a solução de ácido fluorídrico usando uma seringa.
Em seguida, enxágue três vezes com etanol. Para retirar a camada porosa do wafer de silício, primeiro encha o poço da célula de etch com 10 mililitros de uma solução de ácido fluorídrico de um a 29. Em seguida, execute uma constante de 3,7 miliamperes por centímetro quadrado por 250 segundos.
Uma vez que a gravação esteja terminada, remova a célula do circuito. A camada de silício poroso pode ter ondulações visíveis, indicando desprendimento do wafer de silício cristalino. Lave suavemente a solução de ácido fluorídrico e enxágue três vezes cada com etanol e água.
Usando uma ponta de pipeta, quebre firmemente a circunferência da camada de silício poroso para um desprendimento completo. Usando etanol, colete os fragmentos de silício porosos, ou chips, da célula de etch Teflon em um barco de pesagem. Em seguida, transfira os chips para um frasco de vidro para armazenamento.
Em seguida, substitua o etanol no frasco de vidro contendo os chips de silício porosos por dois mililitros de água sem RNase. Tampe firmemente e sele o frasco usando Parafilm. Coloque o frasco de vidro em um banho de sonicator e suspenda de tal forma que o volume de chips de silício porosos esteja completamente submerso abaixo da superfície do banho de água.
Para evitar perda significativa de água durante a sonicação, coloque um frasco volumoso cheio de água, invertido para que a abertura do frasco toque a superfície do banho de água. Em seguida, sonicar os chips de silício poroso por 12 horas a 35 kilohertz com uma potência RF de 48 watts. Após a sonicação, coloque o frasco de vidro em uma superfície plana por uma hora para permitir que as partículas maiores se instalem na parte inferior.
Em seguida, colete o supernatante usando uma pipeta. Em um frasco de vidro, adicione 72,55 microliters de solução DMPC, 15,16 microliters de solução DSPE-PEG e 19,63 microliters de solução DOTAP, e misture por pipetação. Coloque o frasco em um capô de fumaça com uma tampa solta para permitir que o solvente evapore durante a noite.
O filme seco será uma substância nublada, dura, semelhante a gel no fundo do frasco. Em seguida, coloque um tubo de microcentrifuge contendo 150 microliters de nanopartículas de silício porosas em um banho de sônica gelado previamente preparado. Sob uma ultrassonização de 15 minutos, pipeta suavemente 150 microliters de siRNA e 700 microliters de cloreto de cálcio de dois molares nas nanopartículas porosas de silício.
Remova o tubo contendo um mililitro de nanopartículas de silício porosas revestidas de cálcio do sonicador. Encha um béquer largo com água deionizada. Mergulhe uma membrana de policarbonato e quatro suportes de filtro flutuando-os na superfície da água.
Em seguida, monte um kit de extrusão liposoma seguindo as instruções do fabricante. Em seguida, hidrate o filme lipídado seco no frasco de vidro com um mililitro das nanopartículas de silício porosas cobertas de cálcio. Pipeta até que todos os lipídios tenham levantado do fundo do frasco e uma solução nebulosa e homogênea seja observada.
Adicione uma barra de agitação magnética ao frasco de vidro e coloque o frasco em uma placa quente para aquecer as partículas a 40 graus Celsius enquanto agita magneticamente a solução por 20 minutos. Depois disso, conecte uma seringa vazia a um lado da extrusora. Em seguida, encha outra seringa com um mililitro da solução de nanopartículas de silício revestida de lipídio, e anexe a seringa ao outro lado da extrusora.
Comece a extrusão empurrando o pistão lentamente para empurrar as partículas de uma seringa, através da membrana de policarbonato, e para a outra seringa. Repita 20 vezes. Então, colete as partículas extrudadas em um tubo de microcentrífuga.
Prepare um estoque de peptídeos com uma concentração de peptídeo de um miligrama por mililitro na água sem RNase. No tubo de microcentrifuge contendo as nanopartículas de silício porosas revestidas de lipídio fusogênico, adicione 100 microliters do caldo de peptídeo e pipeta suavemente. Mantenha o tubo estático à temperatura ambiente por 20 minutos.
Para remover o excesso de peptídeo ou siRNA e outros excipientes, lave em um filtro centrífugo de 30 quilodalton girando a 5.000 vezes g à temperatura ambiente por uma hora. Centrifugar mais duas vezes com um mililitro de PBS sob as mesmas configurações. Após a centrifugação, resuspenque o último peptídeo-conjugado com nanopartículas de silício porosa revestida de lipídio em PBS na concentração desejada.
As partículas podem ser aliquoted e armazenadas a menos 80 graus Celsius por pelo menos 30 dias. Uma síntese bem sucedida de nanopartículas de silício porosa fusogênicas deve produzir uma solução homogênea, ligeiramente opaca, que pode ser armazenada por 30 dias e descongelada sem causar alterações estruturais. A falha em otimizar a proporção e concentração, bem como ciclos repetidos de congelamento-degelo podem levar à agregação após o carregamento.
À medida que as partículas são extrudidas, o diâmetro hidrodinâmico médio das nanopartículas de silício porosa fusogênicas medidos pela dispersão dinâmica da luz deve ser de aproximadamente 200 nanômetros e o potencial médio zeta aproximadamente positivo de sete milivolts. Após a modificação da superfície com peptídeos de mira, o diâmetro total deve ser inferior a 230 nanômetros, e o potencial zeta médio diminui para menos 3,4 milivolts. A fusão pode ser confirmada rotulando os lipídios fusogênicos com o Fluorophore Lipofófilo DiI e observando a localização in vitro usando microscopia confocal.
A fusão bem sucedida é observada quando os lipídios das nanopartículas de silício porosas fusogênicas transferem o DI PARA a membrana plasmática e são localizados independentes de lisossomos. A fusão mal sucedida mostrará a localização do DII dentro do citoplasma da célula e a co-localização com licomentos. Este sistema de nanopartículas fusogênicas está sendo usado para aplicações terapêuticas não apenas em infecções bacterianas, mas também na terapia adjuvante do câncer e imunoterapia contra o câncer.
Este protocolo pode ser ainda mais otimizado para carregar mais do que siRNAs. O sistema de nanopartículas fusogênicas tem mostrado potencial no carregamento e entrega de cargas aniônicas maiores, como os complexos mRNAs e CRISPR/Cas9.
