As propriedades mecânicas das células vegetais são essenciais para serem levadas em conta ao tentar entender os mecanismos subjacentes ao desenvolvimento. A microscopia da força atômica pode ser usada para medir essas propriedades, e seguir a forma como elas mudam, entre órgãos, tecidos, todos os estágios de desenvolvimento. A principal vantagem dessa técnica, é que ela não é nenhuma invasiva, é relativamente rápida e não requer tratamento para que possa ser diretamente aplicada a amostras vivas.
Para alguém que é novo neste procedimento, a seção cis da amostra é realmente crítica, por isso certifique-se de que você realmente tenha fixação mecânica adequada da amostra. A demonstração visual deste procedimento, é fundamental para entender melhor os meandros da fixação amostral, o controle de qualidade dos fosters e a configuração da medição. Demonstrando o procedimento estarão Simone Bovio, engenheira e Yuchen Long, pós-doutora no meu laboratório.
Para começar, coloque um pedaço de fita dupla face no centro da placa de petri de cinco centímetros de diâmetro. Adicione uma amostra de genesium que foi isolada de um broto de flor à fita. Adicione rapidamente água ao prato até que a amostra esteja completamente coberta para evitar a desidratação.
Em seguida, coloque a amostra em um estágio AFM e mova a cabeça para que ela esteja sobre a amostra. Depois de ter calibrado o cantilever, no software, certifique-se de que o sistema está no modo QI, e aproxime-se da amostra com uma força de ponto de ajuste de quinze nano newtons. Em seguida, defina um comprimento Z de quatro mícrons e coloque a área de varredura em oitenta por 80 mícrons ao quadrado com o número de pixels definido para quarenta por quarenta.
Em seguida, vá para o painel de configurações de imagem avançada e defina o modo em velocidade constante. Além disso, o conjunto estende as velocidades de entrada para duzentos mícrons por segundo, e a taxa de amostra para 25 quilos de hertz. Uma vez definidos os parâmetros, mova a ponta para a região de interesse da amostra.
Verifique se a área a ser escaneada está livre de detritos, localize uma região o mais plana possível e se engaje, então inicie a varredura e use a varredura rápida de baixa força para verificar se a amostra se move. Uma vez que uma área de interesse como foi localizada, selecione uma região que tem quarenta por quarenta e sessenta por sessenta micron ao quadrado, e aumente o número de pixels para dois pixels por mícndo. Em seguida, aumente o set point para quinhentos nano newtons, para obter um recuo de cem a duzentos nano metros.
Diminua o comprimento Z para dois mícrons, e o estender insira velocidades de trato para cem mícrons por segundo, em seguida, aumente a taxa de amostra para cinquenta quilohertz, e comece a digitalizar a amostra. Quando terminar, salve a saída como uma imagem e um arquivo de dados. Abra o software de processamento de dados e carregue o arquivo de dados.
Clique no use este mapa para o botão de processamento em lote, a fim de usar os mesmos parâmetros em todas as curvas do mapa, em seguida, vá para carregar o processo predefinido e selecione o ajuste hertz. Em seguida, vá para a operação da linha de base comutação, e defina subtrair para deslocamento mais inclinação, e X min entre quarenta e sessenta por cento. Na guia posição de ponta vertical, selecione em apertado suave, se preferir trabalhar em dados brutos.
Para selecionar o modelo de ajuste adequado, vá até a guia de ajuste de elasticidade e selecione uma das opções com base na força de adesão esperada. Se não houver adesão ou fraca, use a curva de aproximação e prefira usar o modelo de isnader hertz. Em caso de adesão mais forte, use o modelo de Dergen Milia Dortoprov ou DMD e trabalhe em uma curva retardada.
Agora, defina os parâmetros geométricos da ponta com base na forma nominal da ponta. A ponta usada neste experimento é uma ponta esférica, com o raio de 400 nano metros. Em seguida, defina a razão Poisson para 0,5 e selecione curvas de mudança.
Adicione uma segunda rotina de elasticidade, clicando no ícone pela janela principal e repita as mesmas configurações do parâmetro. Por fim, especifique o recuo desejado em X min e, em seguida, mantenha e aplique a todos para iterar as etapas anteriores em todas as curvas do mapa. Salve os resultados para obter uma imagem em um arquivo ponto tsv.
Para medir com rápidas mudanças de solução, monte uma amostra em uma placa de petri, segurando um pequeno pedaço de mastic adesivo. Sele rapidamente a lacuna entre o mastigal e a base amostral com cola biocompatível. Aguarde que a cola se solidifique e, em seguida, submerse a amostra em meio de cultura ápice líquido, contendo 0,1% de mistura de preservação vegetal.
Depois de calibrar o sistema, abra o software de aquisição e vá primeiro para a janela do parâmetro de verificação. Lá, a mola é constante para a constante de mola fabricada do cantilever ou a determinada constante da mola. Em seguida, ajuste o raio de ponta para 400 nano metros, a razão de equilíbrio amostral para 0,5, a linha de amostra para cento e vinte e oito para garantir a aquisição rápida, a taxa de varredura para 0,2 hertz e o tamanho da varredura para um mícndo.
Em seguida, vá para a janela da rampa e ajuste o tamanho da rampa para cinco mícrons, o limite de trigonometria ao máximo, e o número de amostras para quatro mil seiscentos e oito. Com todos os parâmetros definidos, aproxime-se cuidadosamente da amostra manualmente. Quando a sonda estiver relativamente perto da superfície da amostra, clique na aproximação.
Após o contato, aumente gradualmente o tamanho da digitalização e modifique a taxa de digitalização, até que um equilíbrio desejado seja atingido sem danificar a amostra ou a ponta. Realoque a varredura se a região de medição não estiver como desejada. Quando estiver satisfeito, clique no botão, aponte e atire, para iniciar o ponto e atirar na janela.
Especifique um diretório de salvamento e um nome de arquivo. Em seguida, clique em rampa na próxima varredura para iniciar a gravação. Quando a varredura estiver concluída, a interface de software será redirecionado para a janela de rampa.
Clique na imagem digitalizada para especificar as posições para recuo. Escolha pelo menos três pontos de vista de recuo por célula perto do centro de frutas, configure-o para repetir o recuo três vezes por lado e, em seguida, clique em rampa e capture. No software de análise, abra o arquivo ponto MCA, isso mostra a posição de cada curva de força na imagem digitalizada.
Em seguida, abra uma curva de força a ser analisada. Clique no botão de correção da linha de base e arraste as linhas de painel azul na curva de força, até estender a partida da linha de base de origem e estender a parada da linha de base de origem, ou em 0% e 80%, respectivamente. Em seguida, clique em executar.
Clique em seguida, clique no botão do filtro do carro da caixa e clique em executar para suavizar a curva de força. Em seguida, clique no botão de recuo. Na janela de entrada, defina a curva ativa para estender, o quinto método para o modelo linearizado, o limite de ajuste de força máxima para 99%, o limite de ajuste de força min para 75% e o modelo de ajuste para rigidez.
Analise as curvas de força em um lote. Para isso, clique no botão executar histórico, especifique o diretório do relatório e adicione outras curvas de força que requerem o mesmo tratamento. Quando terminar, clique em executar.
Quando o valor de K estiver em lote montado, clique em histórico e vá para cinco recuos para retornar à janela de recuo. Uma vez lá, mude a força máxima para 10% e a força mínima encaixe o limite para um por cento. Em seguida, ajuste o modelo fit para Hertzian.
Em seguida, abra o arquivo apropriado para exibir os diferentes canais digitalizados. Na janela do canal superior, clique no botão de seção. Isso permitirá a medição da curvatura da superfície da amostra necessária para a dedução da pressão de turgor.
Em seguida, desenhe uma linha através do longo eixo de uma célula, mova os limites da linha de traço para as bordas celulares e regise o valor do raio. Finalmente siga no protocolo de texto, para calcular o módulo médio do jovem, a constante da mola, E, K, e a pressão turgor para cada célula. A imagem à esquerda é um mapa do módulo do jovem, obtido analisando todo o recuo até o ponto de partida de força definido pelo usuário enquanto a imagem à direita, mostra o resultado da análise dos primeiros cem nano metros de recuo.
Aqui, os dois mapas parecem altamente semelhantes, porém, a variação da profundidade do recuo pode levar, em alguns casos, a destacar melhor as heterogeneties amostrais, o que pode ser útil para identificar a localização ou para fornecer informações sobre o comportamento das estruturas internas. Para cada ponto nesses mapas, há uma curva de força subjacente. A curva mostrada aqui, tem dois efeitos que vale a pena mencionar.
Em primeiro lugar, se a parte de aproximação da curva de força terminar em quinhentos nano newtons. O movimento da ponta para baixo continua. O que significa que a força final aplicada pela ponta é maior do que o esperado.
A segunda coisa a notar é a onda na curva de retração destacada pela elipse. Tal acenação pode ser um indicador de movimentação ou vibração da amostra sob a ação da ponta e mudar para um método de fixação diferente pode ser necessário. Utilizando o procedimento documentado neste artigo, todos os parâmetros-chave para uma dedução de pressão turgor, exceto para a espessura da parede celular podem ser recuperados de varreduras afm e recuos.
A curva de força do recuo profundo na posição da cruz vermelha descreve o módulo da parede celular jovem e a rigidez aparente da amostra em diferentes regimes da curva. A fixação da amostra é crucial. Durante o processo de medição, preste atenção aos sinais de instabilidade da amostra.
Escolha cuidadosamente uma região com superfície plana para garantir o recuo perpendicular. Após este procedimento, pode-se monitorar propriedades mecânicas ao longo do tempo e condições diferentes. Pode-se também sobrepor medidas mecânicas com imagens confocal para estudos correlativos.
Essa técnica abre caminho para a articulação da biomecânica com o desenvolvimento da fisiologia e outros processos biológicos.
