Este protocolo nos ajuda a entender como o comportamento do Citoesqueleto microtúbulo ocorre nas plantas. Ao mesmo tempo, também nos ajuda a entender como esses componentes estruturais que influenciam a forma celular e do órgão, respondem a mudanças nas forças mecânicas. Embora, este método exija pouca sofisticação, fornece leitura robusta e quantitativa, as diferenças de resposta mecânica entre diferentes genótipos e condições.
Comece cultivando sementes arabidopsis expressando domínios de ligação de microtúbulos fundidos com proteína fluorescente verde no solo, a 20 e 6 graus Celsius em condições de longo dia por uma semana. Após a germinação, transfira as mudas para novos vasos com espaço de crescimento suficiente para permitir um crescimento vegetativo robusto, e coloque as plantas em 20 e 16 graus Celsius em condições de curto dia. Após três a cinco semanas, transfira as plantas de volta para condições de longos dias na mesma temperatura até que as plantas fugiam, permitindo que a inflorescência cresça até dois a cinco centímetros de comprimento.
Para shoot apical meristem dissection, coloque a inflorescência, e use fórceps afiados para descascar as flores na base dos peduncles, até que seja difícil ver os peduncles a olho nu para remover os botões de flores mais velhos. Use os fórceps para criar uma fenda no agros em um prato de dissecação, e plante a base de inflorescência na grossa Augur. Coloque o prato sob um microscópio dissecando.
Começando com o broto de flor mais antigo, empurre com as fórceps para remover o broto de flor da planta. O meristem apical de tiro é geralmente exposto quando flores mais antigas até o estágio seis a sete são removidas. E use as fórceps para empurrar cada broto de flor para baixo até que o meristem apical de tiro seja visível.
Assim que o meristem apical de tiro é exposto, deixe a amostra recém-dissecada em meio de crescimento em uma caixa de cultura articulada de plástico retangular esterilizada por etanol com o meristem apical de tiro apenas exposto acima da superfície média. Adicione algumas gotas de água deionizada estéril às bordas da caixa de cultura e feche a tampa para manter a umidade dentro da caixa. Enrole a caixa com fita micropora e coloque a caixa de crescimento em condições diárias longas ou contínuas a 22 graus Celsius por 12 a 24 horas.
Quando a planta se recuperar do procedimento de dissecção, cubra a amostra com água deionizada estéril e verifique se há bolhas de ar sob o microscópio dissecador. Transfira a caixa de cultura para um estágio de microscópio confocal vertical e selecione a lente de mergulho de água de 40 ou 60X. Abaixe o objetivo na água e verifique se há bolhas de ar na lente frontal do objeto.
Para remover bolhas, abaixe o palco e limpe suavemente a lente com um tecido óptico. Em seguida, use uma pipeta Pasteur para adicionar um pequeno volume de água à lente frontal do objetivo antes de remermergar a lente na água. Em seguida, use o filtro GFP e o módulo de iluminação epi-iluminadora do microscópio confocal para ajustar o controlador XY para localizar a amostra.
Ajustando a posição dos oculares, posicione o meristem apical de tiro diretamente sob a fonte de luz e concentre-se ao longo do eixo Z até que o ápice esteja localizado. Use um laser capaz de estimular o GFP para iluminar a amostra, e ajustar o zoom óptico do microscópio, de modo que toda a filmagem apical meristem e o estágio um primordia floral estão no campo de visão. Em seguida, ajuste a potência da saída do laser e as configurações de ganho para obter uma relação de sinal para ruído ideal.
Depois de permitir que a amostra se contente por dois a cinco minutos, adquira pilhas Z confocal da amostra em intervalos de fatias Z de 0,25 a 0,5 micrômetros, adicionando aproximadamente 0,3 m de resolução de tamanho de pixel. Ao final da aquisição, remova imediatamente a água e transfira a caixa de cultura de volta para a câmara de crescimento. Para a Micromecânica Shoot Apical Meristem Perturbation, adquira pilhas de imagens pré-ablação da organização de microtúbulos corticais como apenas demonstrado, e descafete a água da caixa de cultura em um prato de cultura.
Transfira o meristem apical de tiro sob um microscópio dissecando, e lentamente se aproximou do meristem apical de tiro com uma agulha de seringa limpa de 0,4 por 20 milímetros. Entre em contato brevemente com a periferia da cúpula do meristem apical com a ponta da agulha para confirmar que a ablação foi concluída. E reabastecer o prato de cultura com água deionizada estéril.
Em seguida, adicione 10 microgramas por mililitro de iodeto de propidium ao prato e imediatamente adquira pilhas de imagem como demonstrado a cada duas horas por seis horas, devolvendo o prato de cultura à incubação entre cada ponto de tempo. Para análise de dados, gere projeções superficiais das pilhas de imagens usando um programa de software de análise de imagem apropriado e realize a extração da anisotropia de microtúbulos corticais usando a Macro da Ferramenta Fibril em Fiji. Aqui, imagens típicas de projeção obtidas a partir de linhas GFP de domínio de ligação microtúbula com células no centro da cúpula contendo microtúbulos corticais desorganizados, células na periferia, tendo uma distribuição circunferencial e células de domínio de fronteira contendo microtúbulos corticais alinhados paralelamente ao eixo longo da célula podem ser observados.
Imagens de lapso de tempo mostram o alinhamento do microtúbulo cortical mudando de uma matriz altamente desordenada para uma matriz mais organizada dentro de seis horas de ablação. Tensores podem ser sobrepostos às imagens de microtúbulos corticais, e as informações extraídas podem ser representadas plotando a anisotropia média ao longo do tempo. Ao ajustar a potência de saída do laser e obter configurações, devemos garantir uma observação clara dos filamentos e tentar evitar a superexposição, pois sinais sobre saturados poderiam distorcer a direção da tração em análise posterior.
A microscopia de força atômica também pode ser realizada para avaliar como as mudanças nas forças mecânicas realmente afetam o estado físico da parede celular.
