Na medicina regenerativa, um protocolo robusto de diferenciação de células-tronco pluripotentes em direção a um tipo específico de célula neural é uma ferramenta valiosa. No nosso caso, esses protocolos foram muito úteis para estudar tanto o desenvolvimento do glioblastoma quanto a doença de Parkinson. Então, primeiro, a geração de organoide tridimensional tem a vantagem de imitar de perto o desenvolvimento fisiológico, e também a produção de neuroesferas calibradas de tamanho a partir de células-tronco pluripotentes tem alta reprodutibilidade.
O procedimento a seguir será demonstrado por Manon Locatelli, um estudante de doutorado do nosso laboratório. 24 horas antes de iniciar a cultura 3D, substitua o meio hESC por meio sem soro complementado com inibidor ROCK de 10 micromolar. As células devem estar em 60% de confluência.
No dia seguinte, desprendem as colônias de hESC como células únicas, removendo o meio e enxaguando com PBS livre de cálcio e magnésio. Em seguida, adicione cinco mililitros de solução de dissolução enzimática e incubar a 37 graus Celsius por um a dois minutos. Depois, colete as células em meio livre de soro com inibidor de ROCK de 10 micromolares e centrifuge as células a 300 vezes g durante cinco minutos.
Após a centrifugação, verifique o tamanho da pelota celular. Remova o supernascer e conte as células em 10 mililitros de meio livre de soro suplementado com inibidor rock de 10 micromolar. Em paralelo, enxágue a placa de microwell com dois mililitros de meio livre de soro por poço e centrifugar a placa a 1.200 vezes g por cinco minutos para remover todas as bolhas, a fim de evitar a formação da neurosfera.
Em seguida, prepare 28,2 milhões de células em 12,5 mililitros de meio sem soro suplementado com inibidor ROCK de 10 micromolar. Dispense 1.000 células por microwell. Centrifugar as células a 300 vezes g por cinco minutos e verificar a repartição homogênea das células na placa de microwell sob um microscópio.
Coloque a placa na incubadora a 37 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, examine a placa de microwell para verificar o tamanho das esferas formadas em cada microwell. Transfira as esferas para uma placa de seis poços usando o meio suplementado com coquetel de inibição dual-SMAD para promover indução neural rápida.
A partir deste passo em frente, as esferas são cultivadas em rotação a 60 rpm para evitar que fiquem juntas ou à placa. No primeiro ao quarto dia, mude o meio a cada dois ou três dias antes de realizar indução neural. Do quarto ao 11º dia, promova a proliferação de rosetas neurais derivadas do HESC adicionando EGF e bFGF a 10 nanogramas por mililitro ao meio B27 suplementado com coquetel dual-SMAD.
Do dia 11 ao dia 13, cultura as esferas em média B27 suplementadas com inibidor de BMP de 0,5 micromolar. Do dia 13 ao dia 21, cultura as esferas em meio B27 suplementadas com GDNF e BDNF a 10 nanogramas por mililitro e um inibidor de gama-secreta micromolar. No dia 21, coloque uma placa de cultura inserindo em um poço de uma nova placa de seis poços.
Depois, adicione um mililitro de meio B27 complementado com fatores de crescimento e inibidores a cada poço sob a inserção da membrana. Posteriormente, emplaque as esferas em uma membrana ptfe hidrofílica depositada em uma inserção de placa de cultura e troque o meio a cada dois ou três dias para as três semanas seguintes de diferenciação. Pare a rotação desta etapa.
A presença de rosetas indica o início da diferenciação neural. Do dia 21 ao 25, cultivar organoides neurais humanos no mesmo meio de maturação neural. Em seguida, do dia 25 ao dia 28, apenas complemente o meio B27 com um inibidor de gama-mãe micromolar.
Do dia 28 ao 39, pare de adicionar o inibidor gama-secretase e continue a cultura organoide neural humana apenas no meio B27. Após três semanas, organoides neurais estão prontos para usar para implantação gic. No dia zero, amplie os CESS em cultura 2D até 60% de confluência.
Em seguida, substitua o meio de células-tronco usado para manter as características de pluripotência de hESCs por um meio livre de soro contendo coquetel de inibição dual-SMAD para iniciar a indução neural e inibidor de ROCK de 10 micromolar para aumentar a taxa de sobrevivência das células durante a passagem no dia seguinte. No primeiro dia, prepare a placa de microwell com 2,5 mililitros por poço de meio livre de soro contendo a mesma concentração de inibidores de ROCHA e moléculas de inibição dual-SMAD. Para diferenciar as células em relação ao padrão ventral do tubo neural, adicione SHH e FGF8 a 100 nanogramas por mililitro e dois micromolars agonistas suavizado.
Depois de adicionar o meio, centrifugar a placa a 1.200 vezes g por cinco minutos para remover bolhas de ar dos microwells. Uma vez que a placa de microwell esteja pronta para usar com meio diferenciador, remova o meio dos hESCs e lave rapidamente com PBS livre de cálcio e cloreto de magnésio. Dissociar as colônias em uma suspensão unicelular adicionando 7,5 mililitros de solução enzimática recombinante em um frasco T75.
Incubar as células por dois minutos a 37 graus Celsius e, em seguida, adicionar 7,5 mililitros de DMEM F12. Posteriormente, colete a suspensão da célula e a centrífuga a 300 vezes g durante cinco minutos. Em seguida, remova o supernascer e conte as células no mesmo meio usado para preparar a placa de microwell.
Ajuste o volume médio para obter uma suspensão celular permitindo formar neurosferas contendo 1.000 células por microwell, preparando 4,7 milhões de células em 2,5 mililitros de médio, e adicionando-o aos 2,5 mililitros anteriores de meio já colocados na placa. Para distribuir corretamente as células em cada microwell, agite suavemente a placa e centrífuga-a a 300 vezes g durante cinco minutos. Em seguida, incubar a placa a 37 graus Celsius por 24 horas para gerar esferas.
No segundo dia, lave suavemente os microwells com meio e transfira as esferas em uma placa de seis poços tratada com tecido. Coloque as esferas em rotação a 37 graus Celsius e troque metade do meio com meio fresco a cada dois ou três dias. No terceiro dia a 13, para aumentar a indução neural e converter-se em progenitores neurais com uma identidade midbrain, suplementar o meio com inibidor GSK-3-beta de três micromolares.
Divida a amostra em duas novas placas de seis poços tratadas com tecido para reduzir a densidade da esfera e evitar a agregação da esfera. No oitavo dia, inicie a maturação neural mudando para um novo meio com fatores de crescimento e alterando o meio a cada dois ou três dias. No dia 21, coloque uma placa de cultura inserindo em um poço de uma nova placa de seis poços e adicione 1,2 mililitros de meio de maturação neural usado para diferenciação da neurosfera sob a inserção da membrana.
Em seguida, deponha a membrana PTFE em uma inserção de placa de cultura. Finalmente, para gerar o organoide neural, sementes em torno de 100 neuroesferas sob condições de interface ar-líquido na membrana PTFE. Pare a rotação desta etapa e mude o meio a cada dois ou três dias até que o ponto de tempo de diferenciação necessário seja alcançado.
Aqui está um esquema de um protocolo padronizado para a geração de organoides neurais dopaminérgicos. A análise de imunofluorescência de organoides neurais dopaminérgicos mostrados nessas imagens indica células imunoreativas TH coexpressando Nurr1, um marcador específico do cérebro médio. Estes dois gráficos representam a cinética da expressão genética TH e Nurr1 avaliada pelo RT-PCR quantitativo.
Aqui está um exemplo de dados brutos registrados com a plataforma MEA. Cada espeto é exibido por uma linha vertical, enquanto o traço restante é ruído. E esta foto representa uma neurosfera depositada no MEA.
Estes gráficos mostram a superposição de picos típicos detectados a partir dos dados brutos. A curva em negrito preto indica a média das curvas vermelhas correspondentes. Este enredo raster mostra os carimbos de tempo associados a cada pico detectado.
As diferentes cores destacam os diferentes eletrodos. Esses protocolos permitem que o pesquisador responda a perguntas sobre a interação das células cancerosas com organoide neural, bem como o rastreamento direto com organoide dopaminérgico.
