Este protocolo nos permite responder a uma variedade de perguntas sobre a forma como a tesoura age sobre as células na solução e fornece um controle significativo sobre a duração e a magnitude da tesoura. Ao contrário de outras técnicas, que detectam o efeito da tesoura nas células que são imobilizadas, essa técnica nos permite aplicar tesoura às células em solução e se presta a um espectro de métodos de detecção de sinal a jusante. Depois de obter sangue periférico de um doador adulto saudável e consentido em um tubo de 4,5 mililitros de citrato de trissódico de 3,8%, centrífugas no sangue para obter plasma rico em plaquetas e usar uma ponta de pipeta cortada em um ângulo de 45 graus para remover cuidadosamente a camada de plasma superior, nublada e amarela rica em plaquetas.
Obtenha a contagem de plaquetas através da contagem completa de plaquetas, e ajuste a contagem de plaquetas para aproximadamente 2,5 vezes 10 para as quintas plaquetas por microliter com plasma de plaquetas humanas agrupadas. Em seguida, coloque a suspensão a 22 graus Celsius com rotação suave. Para o tratamento de ligas, adicione lentamente o anticorpo ou ligante de interesse ao plasma rico em plaquetas, e misture as plaquetas suavemente.
Durante a incubação, ligue o viscometro de placa de cone e coloque a temperatura da placa em 22 graus Celsius. Após cinco a 10 minutos, transfira o plasma rico em plaquetas tratadas para o viscometro de placa de cone controlado pela temperatura diretamente no centro da placa, tomando cuidado para que toda a amostra seja depositada entre o cone e a placa no ponto de contato. Para aplicar a tesoura na amostra, calcule a tesoura de acordo com o manual do viscotômetro e aplique a tesoura na amostra na taxa e duração apropriadas.
No final da aplicação, retire o cone cerca de dois milímetros da placa, de modo que a amostra permaneça em contato com a placa e o cone, e use uma ponta de pipeta de carregamento de gel para coletar de cinco a dez microliters do centro do volume da amostra. Em seguida, incubar a amostra com anticorpos contra os marcadores de interesse da superfície por 20 minutos à temperatura ambiente, e fixar as amostras em 2% de paraformaldeído por 20 minutos à temperatura ambiente. Para analisar as amostras por citometria de fluxo, coletar pelo menos 20.000 eventos para cada condição e quantificar a força do sinal de cada marcador fluorescente, utilizando o valor de altura para a intensidade de cada fluoróforo.
Em seguida, use um controle negativo com albumina ou veículo de soro bovino para desenhar um portão, excluindo eventos fluorescentes de fundo negativos, e quantificar a porcentagem de eventos dentro do portão para todas as condições experimentais. A expressão do marcador de ativação plaquetária em resposta à aplicação da força de tesoura não é regulamentada de forma dependente do tempo. Aqui, leituras representativas da ativação de plaquetas humanas na presença de dois anticorpos voltados para o domínio n-terminal de glicoproteína 1b-IX e um anticorpo de controle sob condições de tesoura e estática são mostrados.
A expressão dos três marcadores de ativação foi significativamente aumentada na presença de forças de tesoura e anticorpos de alvo, em comparação com condições estáticas ou na presença de anticorpos de controle. Notavelmente, o tratamento com anticorpos com uma força desvinculada muito baixa para desencadear a ativação da glicoproteína 1b-IX não desencadeia a regulação do marcador de ativação plaquetária sob condições estáticas ou de força de tesoura. Além disso, o plasma de pacientes imuno-trombocitopenia contendo anticorpos contra glicoproteína 1b-IX desencadeiam respostas dependentes de tesoura em contraste com o plasma de pacientes sem glicoproteína 1b-IX visando anticorpos.
Além das análises flucittométricas, as células expostas à cisalhamento também podem ser lícitas para a análise de manchas ocidentais, ELISA e análise de espectro de massa para determinar quaisquer alterações no nível da proteína. Como sempre, ao usar amostras de sangue ou humanos, certifique-se de usar equipamentos de proteção adequados e seguir as diretrizes de segurança do laboratório e do patógeno nascido no sangue de sua instituição.
