O objetivo desta pesquisa é avaliar a função plaquetária em condições fisiológicas. Estudamos especificamente a função plaquetária usando dispositivos microfluídicos e superfícies biológicas. E usando essa abordagem, fomos capazes de responder a perguntas relacionadas à disfunção plaquetária e ressuscitação hemostática para aplicações em medicina transfusional.
Os ensaios atuais da função plaquetária geralmente testam a capacidade das plaquetas de se agregarem em resposta a um agonista específico de escolha. Os métodos de detecção podem incluir transmissão de luz ou impedância elétrica, e esses ensaios podem utilizar amostras de processo e são testados de forma estagnada. Ao usar essa abordagem microfluídica para testar a função plaquetária, incorporamos a dinâmica dos fluidos para adicionar relevância fisiológica.
A fluidodinâmica desempenha um papel crítico nos mecanismos biológicos envolvidos na função plaquetária durante a hemostasia. Em pacientes com sangramento, estamos particularmente preocupados com a função plaquetária e as intervenções terapêuticas que podem melhorar essa função para obter melhores resultados. Usando essa abordagem de teste de função plaquetária, podemos rastrear as contribuições de diferentes populações de plaquetas em um experimento e desbloquear uma maneira de avaliar as opções terapêuticas para trauma e outras condições hemorrágicas.
Para começar, despeje a base de elastômero de silicone em um prato de pesagem. Adicione o agente de cura de silicone na proporção de dez para um e mexa bem a mistura para garantir a reticulação adequada das cadeias de polímero de silicone. Coloque o molde mestre em uma placa de Petri e despeje o PDMS não curado no molde uniformemente.
Em seguida, coloque a placa de Petri dentro de um dessecador a vácuo por 30 minutos para remover as bolhas da mistura. Para terminar a cura do PDMS, coloque o molde em um forno ajustado a 70 graus Celsius por 90 minutos. Após a cura completa do PDMS, use uma lâmina de barbear ou bisturi para cortar o molde microfluídico.
Faça furos nas bordas dos canais. Agora, coloque a lâmina de vidro e o molde microfluídico com o lado gravado para cima em um limpador de plasma. Ligue a bomba de vácuo e sele a câmara.
Em seguida, coloque o limpador de plasma na configuração Alta e deixe a configuração no limpador por 30 segundos. Depois disso, desligue o limpador de plasma e solte o vácuo. Para unir o molde limpo de plasma e a lâmina de vidro, pressione suavemente os lados que estavam voltados para cima no limpador de plasma juntos.
Coloque o dispositivo microfluídico em um forno ou em uma placa quente a 70 graus Celsius por 10 minutos para finalizar o processo de ligação. Agora, cubra a câmara microfluídica com reagente de colágeno fibrilar equino tipo um através de uma saída designada para a entrada designada. Armazene o dispositivo em um recipiente quente, úmido e fechado para evitar que o colágeno revestido evapore dentro do canal.
Após uma hora, enxágue o dispositivo com PBS na direção oposta do revestimento para remover a solução de colágeno. Para começar, incube o sangue total citrato com um anticorpo CD41 conjugado com fluorescência, usando um fluoróforo de sua escolha. Manchar o sangue por 30 minutos em um balancim nuta.
Em seguida, ligue o microscópio e o software associado. Defina o nível da bomba de seringa de retirada com o microscópio stage e ajuste as configurações da bomba de seringa de acordo com os requisitos experimentais. Em seguida, coloque o dispositivo microfluídico no estágio do microscópio e prenda suas bordas no estágio para evitar movimento.
Agora, conecte o tubo de diâmetro interno de um décimo sexto de polegada a um conector de cotovelo e, em seguida, a uma seringa de 10 mililitros com um conector de diâmetro interno de um décimo sexto de polegada. Encha a seringa de 10 mililitros com PBS estéril e conecte-a à bomba de seringa. Em seguida, insira o conector de cotovelo na saída do dispositivo microfluídico.
Prepare linhas de entrada de aproximadamente 10 centímetros de comprimento com um conector de cotovelo em uma extremidade e um corte angular na outra extremidade. Agora, conecte o conector do cotovelo de entrada à entrada do dispositivo e posicione a linha de entrada em um tubo de microcentrífuga residual colocado em um suporte angular. Use a lente objetiva de 10 vezes para focar nas bordas do canal do dispositivo microfluídico.
Em seguida, prepare as linhas com PBS. Avance manualmente a bomba de seringa para limpar o canal de qualquer PDMS ou detritos. Verifique se há obstruções perto da entrada e saída do canal.
Agora, abra as configurações de captura de imagem salvas ou crie um novo procedimento de captura de imagem para imagens de séries temporais capturadas a cada um ou dois segundos com um canal de campo claro e canais fluorescentes correspondentes aos anticorpos CD41 na amostra de sangue. Obter a amostra de sangue citrato filtrado e misturá-la pipetando para cima e para baixo imediatamente antes de iniciar a experiência. Coloque a amostra no suporte da microcentrífuga angular.
Em seguida, posicione a linha de entrada na amostra de sangue e comece a gravar a captura da imagem. Retire lentamente a seringa para preencher o volume morto no tubo. Assim que o sangue atingir o canal, pressione imediatamente Play na bomba da seringa para retomar o fluxo na taxa desejada.
Execute o experimento até que as plaquetas tenham ocluído totalmente a região estenótica do dispositivo microfluídico ou até o ponto final experimental, que normalmente é de 10 minutos. Quando o experimento estiver concluído, pare a captura da imagem e pare a bomba da seringa. Por fim, salve a captura de imagem no armazenamento apropriado.
