Implementamos microCT com ácido fosfotungstic para aumentar o contraste do tecido mole na investigação não invasiva do ligamento de retenção de orbicularis humanos, uma estrutura delicada dentro da área de órbita. Este protocolo foi otimizado para auxiliar os pesquisadores na investigação não invasiva de tecidos moles humanos e é simples de executar com uma quantidade razoável de despesas. Para obter as amostras, primeiro utilize um lápis colorido para indicar a área de corte na pele para a colheita da amostra.
Confirme que a linha marcada se estende mediadamente a um campus medial, lateralmente a um campus lateral, superiormente a uma borda superior da pálpebra inferior, e inferiormente a um centímetro abaixo da linha da borda orbital. Em seguida, use uma lâmina para cortar os tecidos faciais ao longo da linha marcada, certificando-se de que o corte é profundo o suficiente para a ponta da lâmina tocar o osso. A amostra colhida deve incluir a pele, tecido subcutâneo, músculo, gordura e periósteo.
Após a coleta, fixar imediatamente a amostra em 10% de formalina por cinco a sete dias em temperatura ambiente. Ao final do período de fixação, corte a amostra em três pedaços de cinco a sete milímetros de espessura. Use uma agulha e uma linha preta para costurar o lado superolateral de cada amostra de modo que a direção da amostra possa ser determinada em pontos de tempo posteriores.
Desidratar a amostra em uma série ascendente de concentração de etanol por um dia por concentração, deixando as amostras na solução de 70% de etanol até que estejam manchando. Uma semana antes da tomografia do microcomputador ser agendada, adicione 2,1 gramas de PTA a 210 mililitros de 70% de etanol e coloque a solução em um shaker a 55 a 60 rotações por minuto. Prepare três recipientes plásticos de 70 mililitros para cada peça fatiada.
Quando o corante tiver se dissolvido na solução de álcool, encha os recipientes com a solução. Coloque uma amostra em cada recipiente de 1%PTA, e agite as amostras em 55 a 60 rotações por minuto durante cinco a sete dias. Quando a mancha estiver completa, armazene as amostras em 70% de etanol fresco por uma semana para se preparar para a varredura.
Para a varredura de microCT, enrole as amostras em Parafilm para evitar a secagem e coloque uma amostra na bandeja do scanner. Ajuste a tensão de origem do scanner para 70 quilovolts, a corrente de origem para 114 microamps, o filtro de alumínio para 0,5 milímetros, o tamanho do pixel da imagem para 20 micrômetros quadrados, os pixels para 2.240 por 2.240, a exposição a 500 milissegundos, e o passo de rotação para 0,3 graus. Em seguida, inicie a varredura.
Quando a digitalização estiver concluída, abra o software de reconstrução e selecione Ações e Conjunto de Dados Aberto para iniciar os arquivos digitalizados. Selecione a guia Configurações e defina a redução dos artefatos do anel para sete e a correção de endurecimento do feixe. Para começar a reconstrução, selecione Iniciar.
Os dados finais serão armazenados na pasta designada. No final da reconstrução, abra o software de redimensionamento de arquivos e selecione o conjunto de dados Source para iniciar os arquivos reconstruídos. Selecione jpg na guia conjunto de dados Destino e selecione a opção 1/2 Redimensionamento com a opção Qualidade sem interpolação Em seguida, ajuste a barra de slides para 100 na guia de compactação de imagem e inicie a conversão.
Para reconstrução 3D, abra o software de renderização de volume 3D e selecione Ações e Dados de Volume de Carga. Para ajustar o brilho e o nível de contraste, modifique a função de transferência de forma no histograma na guia Editor de Função de Transferência. Em seguida, selecione Opções e Iluminação e selecione os ícones sombras e iluminação de superfície para obter um tom de modelagem realista.
Clique e arraste e clique com o botão direito do mouse e arraste para mover e girar a imagem 3D para encontrar a melhor visualização, rolando para ampliar ou sair conforme desejado. Clique em Mudar e arraste para deslizar o local para ver as imagens seccionais. Acenda o ícone Luz e ajuste a barra de indicação de iluminação para encontrar a melhor iluminação para visualização, em seguida, desligue o ícone Luz e feche a guia Iluminação.
Na guia Opções, selecione Mostrar e Cortar caixa para ocultar a caixa para a imagem final. Em seguida, selecione Ações e Salvar imagem para armazenar a imagem. Esta reconstrução detalhada do ORL foi realizada por microCT com preparação de PTA como demonstrado, permitindo a visualização de uma estrutura fibromuscular ligamentou que se estende obliquamente entre a dermis e o peristo.
Na visão coronal, a quantidade e a complexidade das fibras aumentam lateralmente. Na visão horizontal, observa-se um elaborado trabalho de malha com formação arborizada. Na visão sagital, as espessuras das fibras ORL diminuem inferiormente.
No geral, esta observação multidirecional comprova que o ORL é composto por uma malha multicamadas de placas contínuas com variações no número e espessura das fibras, dependendo de sua localização. Quando a duração da coloração é insuficiente em comparação com o volume de um espécime, a imagem final pode incluir um buraco vazio na área central do espécime. Outros agentes ao lado do PTA podem ser usados e diferentes agentes têm diferentes méritos ou características de coloração.
Portanto, é útil otimizar a região de coloração de acordo com o seu experimento.
