Este protocolo demonstra um método aprimorado para a aquisição de células epiteliais dentárias humanas. É difícil identificar a pelota celular agregada durante os procedimentos. Tenha cuidado ao lidar com supernascer para evitar a perda de populações celulares.
Para começar, colhe folículos dentários durante a extração cirúrgica de terceiros molares impactados. Inicie procedimentos de isolamento celular ou armazene os folículos dentários a quatro graus Celsius em DPBS com 3% de penicilina-estreptomicina. Para lavar os folículos dentários, segure o folículo dentário com pinça e coloque-o no tubo de lavagem 1.
Agite suavemente 10 a 15 vezes. Tire-o e coloque-o no tubo 2. Mais uma vez, agite de 10 a 15 vezes.
Finalmente, retire-o e coloque-o no tubo 3, em seguida, agite-o. Depois de lavar três vezes, coloque o folículo dental em um prato de cultura de 60 milímetros. Pique o tecido com tesoura de tecido até que o folículo dentário tenha uma aparência polpa ou macia.
Use uma pequena seção lateral do prato de cultura para minimizar a perda de tecido. Misture um mililitro cada uma da solução de colagenase tipo 1 e protease em um tubo cônico de 15 mililitros. Transfira o tecido picado para o tubo cônico de 15 mililitros, em seguida, agite-o suavemente e incuba-o por uma hora a 37 graus Celsius.
Adicione cinco mililitros de 0,05% trypsin-EDTA ao tubo. Agite-o e incubar por 15 minutos a 37 graus Celsius. Prepare o meio queratincyte contendo meio bovino sem soro de queratincyte e soro bovino 10%.
Adicione três mililitros de meio queratincyte em um novo tubo cônico de 50 mililitros. Coloque um coador de 40 micrômetros em cima deste tubo. Em seguida, aspire o supernaente do tubo contendo o tecido com uma pipeta sorológica de 10 mililitros e passe-o através do coador.
Transfira a suspensão coletada para um tubo cônico de 15 mililitros. Centrifugar o tubo e remover o supernaspeso. Em seguida, adicione três mililitros de meio sem soro de queratinócito.
Centrifugar por mais três minutos e remover o supernatante. Coloque a população de células únicas em um prato de cultura de 60 milímetros usando o meio sem soro de queratinócito. Mantenha o prato de cultura com um volume final de cinco mililitros em uma atmosfera umidificada de 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius.
Células com morfologia epitelial apareceram dentro de sete a dez dias após o revestimento de populações de células únicas. O número de células epiteliais em forma de paralelepípedo variou de um a 10 no momento do surgimento e as células se expandiram para colônias ao longo do tempo. O passo mais crucial é picar o folículo dentário em pequenas partículas.
Aumenta a separação de células únicas do tecido folículo. Células mesenquimais podem ser isoladas do folículo dental humano. O soro que contém ambiente cultural seleciona células mesenquimais e inibe o crescimento epitelial de populações de células únicas.
Este protocolo fornece o método de aquisição das células epiteliais dentárias humanas. As células epiteliais derivadas do folículo dental podem ser utilizadas para o estudo de interações epiteliais-mesenquimais dentárias.
