A plasticidade sináptica de longo prazo, especificamente, a potencialização a longo prazo e a depressão a longo prazo têm sido amplamente investigadas ao longo da orientação transversal do hipocampo. Também foi examinado ao longo da orientação longitudinal. No entanto, quando se trata da orientação longitudinal, muito pouca atenção tem sido dada ao eixo LONGITUDINAL CA1 do hipocampo no que diz respeito à plasticidade sináptica.
Uma publicação anterior do nosso laboratório mostrou que os neurônios piramimais CA1 do hipocampo formam conexões associacionais que poderiam suportar a plasticidade sináptica. Para maior compreensão deste protocolo, recomenda-se que você se refira à publicação anterior com a referência abaixo. Injete uretano para anestesiar o rato.
Coloque o mouse totalmente anestesiado em uma almofada de aquecimento definida a 37 graus Celsius. Aplique gel ocular para umedecer os olhos. Fixar o crânio do mouse firmemente usando o grampo ocular.
O grampo ocular dá a liberdade de mobilidade para o experimentador durante os procedimentos cirúrgicos. E pode ser particularmente útil para experimentos envolvendo o córtex auditivo, também. No entanto, muito cuidado deve ser tomado para obter as coordenadas estereotaxas exatas.
Separe o tecido e os músculos subcutâneos no final do osso interparietal e occipital do camundongo com o bisturi. Borrite a matéria dura seca com cotonete. Então você perfura a cisterna magna para drenar o fluido cefalorraquidiano.
Conecte um cotonete para continuar drenando o fluido cefalorraquidiano. Corte e remova a pele do couro cabeludo e mantenha a região exposta seca. Marque os pontos correspondentes à região hipocampal usando a ajuda de uma pinça veniyar.
Faça uma incisão no crânio acima da região dorsal do hipocampo ao longo dos pontos marcados usando um bisturi ou broca de alta velocidade enquanto observa sob um microscópio. Mantenha o tecido cerebral exposto úmido aplicando soro fisiológico ou um óleo inerte. Corrija e posicione os eletrodos de estimulação e gravação firmemente no suporte estereotaxista.
Ajuste a estimulação e gravação de eletrodos acima do hipocampo dorsal CA1. Use o cérebro do rato na coordenada estereotaxic como guia na localização da coordenada para a região hipocampal longitudinal dorsal ca1. Para gravações usando eletrodos multicanais, primeiro localize suas coordenadas estereoxigráficas para a região hipocampal ca1 usando o primeiro canal.
Posicione os eletrodos restantes de tal forma que o ângulo de estimulação e registro de eletrodos esteja na faixa de 30 graus a 60 graus em relação à linha média do ponto bregma. Este ângulo corresponde à orientação longitudinal da região hipocampal ca1. Ligue o sistema de gravação.
Abra o software neural para gravação e aquisição de dados. Abaixe os eletrodos de gravação e estimulação lentamente usando o micromanipulador até que ele apenas toque a superfície do cérebro. Observe um aumento na impedância justo quando o eletrodo toca a superfície cerebral.
Isso pode ser observado no canal vermelho mostrado na tela. Abaixe lentamente os eletrodos para a profundidade aproximada correspondente às coordenadas estereotaxas escolhidas para o hipocampo CA1. Dê estimulação até que seja observado um potencial pós-sinápático repleto de evocação estável.
Realize uma curva de saída de entrada para detectar a intensidade máxima de estímulo. Use a curva de saída de entrada para definir a intensidade da linha de base e para definir a intensidade de estímulo para evocar estimulação de alta frequência ou estimulação de baixa frequência. Regisso potencial local por uma hora após estimulação de alta frequência ou estimulação de baixa frequência.
Exporte dados e analise usando software de escolha. Pobres 400 ml de solução de corte já preparada em um frasco separado e oxigenar por aproximadamente 20 minutos. Pobres 200 ml da solução de corte oxigenado.
Cubra no para filme e transfira para um freezer de 80 graus por aproximadamente 20 minutos para fazer uma lama. Pre coiule os 200 ml restantes de solução de corte em uma câmara de segurando fatias cerebrais e mantenha em bot de água de 32 graus Celsius com borbulhamento contínuo. Traga a solução de corte refrigerado e pobre aproximadamente 50 ml em um béquer.
Decapitar o rato anestesiado. Corte a pele cobrindo o crânio do rato e corte o pedaço do crânio ao longo da linha média até o osso occipital. Abra o crânio com fórceps sem cortes.
Retire suavemente o cérebro com uma espátula e coloque na solução de corte refrigerado no béquer. Separe os dois hemisférios cerebrais ao longo da linha média com uma lâmina de bisturi. Isole o hipocampo, desprendendo-o suavemente do córtex com uma espátula.
Corte a extremidade septal e temporal do hipocampo isolado. Aplique uma pequena quantidade de cola na placa de corte. Para a fatia hipocampal longitudinal CA1, conecte a região ca3 do hipocampo à placa de corte com a cola.
Para fatia transversal, que servirá de controle, conecte a extremidade ventral do hipocampo à placa de corte do vibratome. Coloque-o na câmara de corte. Ajuste os parâmetros do vibratome.
Corte o hipocampo ligado com o vibratome. Uma boa fatia cerebral hipocampal ca1 longitudinal terá uma camada de CA1, e duas camadas de giro dento. Além disso, os oriens estrato e o radiador estrato da região do CA1 estarão presentes.
Alternativamente, uma fatia cerebral hipocampal transversa terá as regiões desnúrada ca3 e CA1 em tato. Transfira as fatias cerebrais para a câmara de corte cerebral no robô de água. Incubar por 20 minutos a uma temperatura de 32 graus Celsius e levar à temperatura ambiente para recuperação.
Sobrevoe continuamente o servo ACS na câmara de gravação à velocidade de 2 ml por minuto. Transfira a fatia cerebral para a câmara de gravação, ajuste a posição da fatia cerebral com fórceps sem cortes e segure-a no lugar com um hap. Ligue o software para aquisição de dados.
Corte cerebral longitudinal. Para fatias longitudinais, posicione a estimulação e a gravação do eletrodo nos oriens estrato. Coloque o eletrodo de estimulação no lado septal ou temporal da fatia cerebral com gravação da mesma camada.
Alternativamente, posicione a estimulação e o eletrodo de gravação no radiador do estrato, coloque o eletrodo de estimulação no lado septo ou temporal da fatia cerebral. Para fatias transversais como controle, posicione o eletrodo de estimulação na região da via colateral CA3 Schaffer e o eletrodo de gravação na região do CA1. Ligue o gerador de estímulo isolador e dê estimulação.
Ajuste a profundidade do eletrodo de gravação até que seja observado um potencial pós-sináptico excitante e excitante. Realize uma curva de saída de entrada para detectar a intensidade máxima de estímulo. Use a curva de saída de entrada para definir a intensidade de estímulo para gravação de linha de base evocando estimulação de alta frequência ou estimulação de baixa frequência.
Consulte o PDF anexado para parâmetros que induzem a potencialização a termo solitário ou depressão a longo prazo. Evocou potencial pós-sináptico evocado aumentado em resposta à estimulação de alta frequência in vivo. Isso mostra que o HIPOcampal longitudinal CA1 suporta a potencialização a longo prazo.
Para as fatias cerebrais longitudinal de CA1 hipocampal, o aumento em resposta à estimulação de alta frequência foi observado tanto no lado septo quanto no temporal de oriens estrato e radiador de estrato. Isso mostra que a plasticidade sináptica induzida ao longo da região do hipocampo longitudinal CA1 não é linear ou específica de direção. Usando protocolos já estabelecidos para depressão a longo prazo, nenhuma depressão a longo prazo foi induzida tanto in vivo quanto in vitro.
Como conclusão, mostramos como investigar a plasticidade sináptica de longo prazo na região longitudinal hipocampal CA1, tanto in vivo quanto in vitro. Mais detalhes do protocolo podem ser encontrados no PDF que acompanha este vídeo para ajudá-lo a investigar a plasticidade sináptica de longo prazo ao longo da região longitudinal hipocampal CA1 em seus próprios laboratórios.
