Langfristige synaptische Plastizität, insbesondere Langzeitpotenzierung und Langzeitdepression wurden entlang der Querorientierung des Hippocampus umfassend untersucht. Es wurde auch entlang der Längsausrichtung betrachtet. Wenn es jedoch um die Längsausrichtung geht, wurde der Längsachse CA1 des Hippocampus in Bezug auf die synaptische Plastizität nur sehr wenig Aufmerksamkeit geschenkt.
Eine frühere Veröffentlichung aus unserem Labor hat gezeigt, dass die CA1-Pyramidenneuronen des Hippocampus Assoziationsverbindungen bilden, die synaptische Plastizität unterstützen könnten. Für ein weiteres Verständnis dieses Protokolls wird empfohlen, dass Sie sich auf die vorherige Veröffentlichung mit der unten angegebenen Referenz beziehen. Injizieren Sie Urethan, um die Maus zu anästhesieren.
Legen Sie die voll beeinte Maus auf ein Heizkissen, das auf 37 Grad Celsius eingestellt ist. Tragen Sie Augengel auf, um die Augen zu befeuchten. Fixieren Sie den Schädel der Maus fest mit der Augenklemme.
Die Augenklemme gibt dem Experimentator bei chirurgischen Eingriffen die Freiheit der Beweglichkeit. Und es kann besonders nützlich sein für Experimente mit dem auditiven Kortex, sowie. Es muss jedoch sehr darauf geachtet werden, die genauen stereotaxic-Koordinaten zu erhalten.
Trennen Sie das subkutane Gewebe und die Muskeln am Ende des interparietalen und okzipitalen Knochens der Maus mit dem Skalpell. Die Dura-Materie mit Wattestäbchen trocknen lassen. Dann punktieren Sie die Zisterne magna, um die Zerebrospinalflüssigkeit zu entleeren.
Befestigen Sie einen Wattestäbchen, um die Zerebrospinalflüssigkeit weiter zu entleeren. Schneiden und entfernen Sie die Haut auf der Kopfhaut und halten Sie die exponierte Region trocken. Markieren Sie die Punkte, die der Hippocampusregion entsprechen, mit Hilfe eines Veniyar-Sättels.
Machen Sie einen Schnitt im Schädel über der dorsalen Region des Hippocampus entlang der markierten Punkte mit einem Skalpell oder Hochgeschwindigkeitsbohrer während der Beobachtung unter dem Mikroskop. Halten Sie das exponierte Hirngewebe feucht, indem Sie physiologische Kochsalzung oder ein inertes Öl anwenden. Fixieren und positionieren Sie die Stimulations- und Aufnahmeelektroden fest im Stereotaxienhalter.
Passen Sie die Stimulations- und Aufzeichnungselektroden über dem ca1 dorsalen Hippocampus an. Verwenden Sie das Maushirn in stereotaxic-Koordinate als Leitfaden bei der Suche nach der Koordinate für dorsale Längs-CA1-Hippocampus-Region. Für Aufnahmen mit Mehrkanalelektroden lokalisieren Sie zuerst Ihre stereotaxic Koordinaten für die CA1 Hippocampusregion mit dem ersten Kanal.
Positionieren Sie die verbleibenden Elektroden so, dass der Stimulations- und Aufnahmewinkel im Bereich von 30 Grad bis 60 Grad im Verhältnis zur Mittellinie vom Bregmapunkt liegt. Dieser Winkel entspricht der Längsausrichtung der Hippocampusregion CA1. Schalten Sie das Aufzeichnungssystem ein.
Öffnen Sie die neuronale Software für die Aufzeichnung und Datenerfassung. Senken Sie die Aufnahme- und Stimulationselektroden langsam mit dem Mikromanipulator, bis er nur die Oberfläche des Gehirns berührt. Beobachten Sie eine Erhöhung der Impedanz, wenn die Elektrode die Gehirnoberfläche berührt.
Dies kann im roten Kanal auf dem Bildschirm beobachtet werden. Senken Sie die Elektroden langsam auf die ungefähre Tiefe, die den gewählten stereotaxic-Koordinaten für den CA1-Hippocampus entspricht. Geben Sie Stimulation, bis ein stabiles evoziertes exzitatorisches postsynaptisches Potenzial beobachtet wird.
Führen Sie eine Input-Output-Kurve aus, um die maximale Stimulusintensität zu erkennen. Verwenden Sie die Eingangs-Output-Kurve, um die Ausgangsintensität und die Stimulusintensität für die Evokierung von Hochfrequenzstimulation oder Niederfrequenzstimulation festzulegen. Zeichnen Sie das lokale volle Potenzial für eine Stunde nach Hochfrequenzstimulation oder Niederfrequenzstimulation auf.
Exportieren Sie Daten und analysieren Sie mit Software der Wahl. Schlechte 400 ml bereits vorbereitete Schneidlösung in einen separaten Kolben und Sauerstoffat für ca. 20 Minuten. Schlechte 200 ml der sauerstoffhaltigen Schneidlösung.
In Parafolie abdecken und ca. 20 Minuten in einen 80-Grad-Gefrierschrank transferieren, um einen Schlamm zu machen. Die restlichen 200 ml Schneidlösung in einer Hirnscheiben-Haltekammer arm und in Wasserbot von 32 Grad Celsius mit kontinuierlichem Sprudeln aufbewahren. Chili-Slicing-Lösung und schlecht ca. 50 ml in einem Becher.
Enthaupten Sie die anästhesierte Maus. Schneiden Sie die Haut, die den Schädel der Maus bedeckt und schneiden Sie das Schädelstück entlang der Mittellinie zum Okzipitalknochen. Öffnen Sie den Schädel mit stumpfer Zange.
Das Gehirn vorsichtig mit einem Spachtel aushöhlen und in die gekühlte Schneidlösung in den Becher legen. Trennen Sie die beiden Gehirnhälften entlang der Mittellinie mit einer Skalpellklinge. Isolieren Sie den Hippocampus, indem Sie ihn sanft mit einem Spachtel vom Kortex lösen.
Schneiden Sie das septale und zeitliche Ende des isolierten Hippocampus aus. Tragen Sie eine kleine Menge Kleber auf die Schneidplatte auf. Bei Längs-CA1-Hippocampus-Scheibe den CA3-Bereich des Hippocampus mit dem Kleber an der Schneidplatte befestigen.
Bei Querscheiben, die als Kontrolle dienen, befestigen Sie das ventrale Ende des Hippocampus an der Schneidplatte des Vibratome. Legen Sie es in die Schneidkammer. Legen Sie die Vibratome-Parameter fest.
Schneiden Sie den beigefügten Hippocampus mit dem Vibratome. Eine gute Längs-CA1-Hippocampus-Gehirnscheibe hat eine CA1-Schicht und zwei Schichten dentate Gyrus. Außerdem werden die Schichten oriens und die Schicht radiatum der CA1-Region vorhanden sein.
Alternativ wird eine transversale Hippocampus-Gehirnscheibe die Dentat-Gyrus-Regionen CA3 und CA1 im Takt haben. Übertragen Sie die Gehirnscheiben auf die Gehirnscheibe Haltekammer im Wasserbot. 20 Minuten bei einer Temperatur von 32 Grad Celsius inkubieren und zur Erholung auf Raumtemperatur bringen.
Den ACS-Serf mit einer Geschwindigkeit von 2 ml pro Minute kontinuierlich in die Aufnahmekammer überziehen. Übertragen Sie die Gehirnscheibe in die Aufnahmekammer, passen Sie die Position der Gehirnscheibe mit stumpfer Zange an und halten Sie sie mit einem Hap an Ort und Stelle. Schalten Sie die Software für die Datenerfassung ein.
Längshirnscheibe. Positionieren Sie bei Längsschnitten die Stimulations- und Aufnahmeelektrode in den Schichten. Platzieren Sie die Stimulationselektrode entweder auf der septalen oder zeitlichen Seite der Gehirnscheibe mit Aufnahme aus derselben Schicht.
Alternativ positionieren Sie die Stimulations- und Aufnahmeelektrode im Stratum radiatum, platzieren Sie die Stimulationselektrode entweder in der septalen oder zeitlichen Seite der Hirnscheibe. Positionieren Sie bei Querscheiben als Steuerung die Stimulationselektrode auf dem CA3 Schaffer-Kollateralwegbereich und die Aufnahmeelektrode im CA1-Bereich. Schalten Sie den Isolator-Stimulusgenerator ein und geben Sie Stimulation.
Passen Sie die Aufnahmeelektrodentiefe an, bis ein stabiler evozitationsevoktiones postsynaptisch gefülltes Potential beobachtet wird. Führen Sie eine Input-Output-Kurve aus, um die maximale Stimulusintensität zu erkennen. Verwenden Sie die Eingangs-Ausgangs-Kurve, um die Stimulusintensität für die Basisaufzeichnung festzulegen, die eine hochfrequente Stimulation oder eine Niederfrequenzstimulation hervorruft.
Siehe die beigefügte PDF für Parameter bei der Induktion von einsamer Potenzierung oder Langzeitdepression. Evokiertes exzitatorisches postsynaptisches Potenzial erhöhte sich als Reaktion auf die Hochfrequenzstimulation in vivo. Dies zeigt, dass Längshippocampus CA1 eine langfristige Potenzierung unterstützt.
Bei Längs-Hippocampus-CA1-Gehirnscheiben wurde eine Zunahme der Reaktion auf hochfrequente Stimulation sowohl auf der septalen als auch auf der zeitlichen Seite von Stratum-Oriens und Stratum radiatum beobachtet. Dies zeigt, dass die synaptische Plastizität, die entlang der Längs-Hippocampus-CA1-Region induziert wird, nicht linear oder richtungsspezifisch ist. Mit bereits etablierten Protokollen für Langzeitdepressionen wurde keine Langzeitdepression sowohl in vivo als auch in vitro induziert.
Als Fazit haben wir Ihnen gezeigt, wie Sie die langfristige synaptische Plastizität in der Längshippocampus-Region CA1 sowohl in vivo als auch in vitro untersuchen können. Weitere Details zum Protokoll finden Sie in der PDF-Datei zu diesem Video, um Sie bei der Untersuchung der langfristigen synaptischen Plastizität entlang der Längs-Hippocampus-Region CA1 in Ihren eigenen Labors zu unterstützen.
