La plasticidad sináptica a largo plazo, específicamente, la potenciación a largo plazo y la depresión a largo plazo se han investigado ampliamente a lo largo de la orientación transversal del hipocampo. También se ha mirado a lo largo de la orientación longitudinal. Sin embargo, cuando se trata de la orientación longitudinal, se ha prestado muy poca atención al eje longitudinal CA1 del hipocampo con respecto a la plasticidad sináptica.
Una publicación anterior de nuestro laboratorio ha demostrado que las neuronas piramidales CA1 del hipocampo forman conexiones asociacionales que podrían apoyar la plasticidad sináptica. Para una mayor comprensión de este protocolo, se recomienda que consulte la publicación anterior con la referencia dada a continuación. Inyecte uretano para anestesiar al ratón.
Coloque el ratón completamente anestesiado en una almohadilla de calentamiento ajustada a 37 grados Celsius. Aplique gel para los ojos para humedecer los ojos. Fije el cráneo del ratón firmemente usando la abrazadera del ojo.
La abrazadera para los ojos proporciona la libertad de movilidad para el experimentador durante los procedimientos quirúrgicos. Y puede ser particularmente útil para experimentos que involucran la corteza auditiva, también. Sin embargo, se debe tener mucho cuidado para obtener las coordenadas estereotaxicas exactas.
Separe el tejido subcutáneo y los músculos al final del hueso interparietal y occipital del ratón con el bisturí. Seque la materia dura con un hisopo de algodón. Luego perforas la cisterna magna para drenar el líquido cefalorraquídeo.
Adjunte un hisopo de algodón para seguir drenando el líquido cefalorraquídeo. Cortar y eliminar la piel del cuero cabelludo y mantener la región expuesta seca. Marque los puntos correspondientes a la región del hipocampo utilizando la ayuda de una pinza venyar.
Haga una incisión en el cráneo por encima de la región dorsal del hipocampo a lo largo de los puntos marcados usando un bisturí o un taladro de alta velocidad mientras observa bajo un microscopio. Mantenga el tejido cerebral expuesto húmedo aplicando solución salina fisiológica o un aceite inerte. Fije y coloque firmemente los electrodos de estimulación y grabación en el soporte estereotaxico.
Ajuste la estimulación y los electrodos de grabación por encima del hipocampo dorsal CA1. Utilice el cerebro del ratón en la coordenada estereotaxica como guía para localizar la coordenada para la región del hipocampo CA1 longitudinal dorsal. Para grabaciones con electrodos multicanal, primero localice las coordenadas estereotaxicas para la región del hipocampo CA1 utilizando el primer canal.
Coloque los electrodos restantes de manera que el ángulo de estimulación y los electrodos de grabación estén en el rango de 30 grados a 60 grados en relación con la línea media desde el punto de bregma. Este ángulo corresponde a la orientación longitudinal de la región del hipocampo CA1. Encienda el sistema de grabación.
Abra el software neuronal para la grabación y la adquisición de datos. Baje los electrodos de grabación y estimulación lentamente usando el micromaniprógrafo hasta que solo toque la superficie del cerebro. Observe un aumento en la impedancia justo cuando el electrodo toca la superficie cerebral.
Esto se puede observar en el canal rojo que se muestra en la pantalla. Baje lentamente los electrodos a la profundidad aproximada correspondiente a las coordenadas estereotaxicas elegidas para el hipocampo CA1. Dar estimulación hasta que se observe un potencial postsináptico excitatorio lleno de evocación estable.
Realice una curva de entrada-salida para detectar la máxima intensidad de estímulo. Utilice la curva de entrada-salida para establecer la intensidad basal y para establecer la intensidad de estímulo para evocar estimulación de alta frecuencia o estimulación de baja frecuencia. Registre el potencial completo local durante una hora después de la estimulación de alta frecuencia o la estimulación de baja frecuencia.
Exporte datos y analice utilizando el software de su elección. Pobre 400 ml de solución de corte ya preparada en un matraz separado y oxigenado durante aproximadamente 20 minutos. Pobre 200 ml de la solución de corte oxigenada.
Cubrir en para película y transferir a un congelador de 80 grados durante aproximadamente 20 minutos para hacer un slush. Pobre los 200 ml restantes de solución de corte en una cámara de retención de la rebanada cerebral y mantener en el robot de agua de 32 grados Celsius con burbujeo continuo. Sacar la solución de corte refrigerada y la falta de aproximadamente 50 ml en un vaso de precipitados.
Decapitar el ratón anestesiado. Corta la piel que cubre el cráneo del ratón y corta la pieza del cráneo a lo largo de la línea media hasta el hueso occipital. Abre el cráneo con fórceps contundentes.
Saque suavemente el cerebro con una espátula y colóquelo en la solución de corte refrigerada en el vaso de precipitados. Separe los dos hemisferios cerebrales a lo largo de la línea media con una hoja de bisturí. Aísle el hipocampo desprendiéndolo suavemente de la corteza con una espátula.
Corte el troce y el extremo temporal del hipocampo aislado. Aplique una pequeña cantidad de pegamento a la placa de corte. Para la rebanada longitudinal del hipocampo CA1, conecte la región CA3 del hipocampo a la placa de corte con el pegamento.
Para la rebanada transversal, que servirá como control, conecte el extremo ventral del hipocampo a la placa de corte del vibratoma. Colóquelo en la cámara de corte. Ajuste los parámetros del vibratomo.
Corta el hipocampo unido con el vibratome. Una buena rebanada cerebral del hipocampo CA1 longitudinal tendrá una capa de CA1 y dos capas de giro dentuado. También, el estrato oriens y el estrato radiatum de la región CA1 estarán presentes.
Alternativamente, una rebanada transversal del cerebro del hipocampo tendrá las regiones de dento gyrus CA3 y CA1 en tacto. Transfiera las rebanadas cerebrales a la cámara de retención de la rebanada cerebral en el bot de agua. Incubar durante 20 minutos a una temperatura de 32 grados centígrados y llevar a temperatura ambiente para su recuperación.
Superfuerte continuamente el serf ACS en la cámara de grabación a una velocidad de 2 ml por minuto. Transfiera la rebanada cerebral a la cámara de grabación, ajuste la posición de la rebanada cerebral con fórceps contundentes y sosténjes en su lugar con una arpa. Active el software para la adquisición de datos.
Rebanada longitudinal del cerebro. Para rodajas longitudinales, coloque la estimulación y el electrodo de grabación en el estrato oriens. Coloque el electrodo de estimulación en el lado septal o temporal de la rebanada cerebral con la grabación de la misma capa.
Alternativamente, coloque la estimulación y el electrodo de grabación en el estrato radiatum, coloque el electrodo de estimulación en el lado septal o temporal de la rebanada cerebral. Para las rodajas transversales como control, coloque el electrodo de estimulación en la región de la vía colateral CA3 Schaffer y el electrodo de grabación en la región CA1. Encienda el generador de estímulo del aislador y dé estimulación.
Ajuste la profundidad del electrodo de grabación hasta que se observe un potencial de llenado postsináptico excitatorio evoctivo estable. Realice una curva de entrada-salida para detectar la máxima intensidad de estímulo. Utilice la curva de entrada-salida para establecer la intensidad de estímulo para el registro de línea base que evoca estimulación de alta frecuencia o estimulación de baja frecuencia.
Consulte el PDF adjunto para conocer los parámetros para inducir la potenciación a largo plazo o la depresión a largo plazo. El potencial postsinóptico excitatorio evocado aumentó en respuesta a la estimulación de alta frecuencia in vivo. Esto demuestra que el hipocampo longitudinal CA1 apoya la potenciación a largo plazo.
Para las rebanadas cerebrales CA1 del hipocampo longitudinal, se observó un aumento en respuesta a la estimulación de alta frecuencia tanto en el lado septal como temporal del estrato oriens y del estrato radiatum. Esto muestra que la plasticidad sináptica inducida a lo largo de la región longitudinal del hipocampo CA1 no es lineal ni específica de la dirección. Utilizando protocolos ya establecidos para la depresión a largo plazo, no se indujo depresión a largo plazo tanto in vivo como in vitro.
Como conclusión, le hemos mostrado cómo investigar la plasticidad sináptica a largo plazo en la región longitudinal del hipocampo CA1 tanto in vivo como in vitro. Más detalles del protocolo se pueden encontrar en el PDF que acompaña a este video para ayudarle a investigar la plasticidad sináptica a largo plazo a lo largo de la región CA1 del hipocampo longitudinal en sus propios laboratorios.
