Este protocolo pode ajudar na descoberta de potenciais moléculas antivirais através de uma abordagem orientada por mecanismos. O tempo de adição determina em que etapa da infecção a pequena molécula exibe sua atividade antiviral. Acoplamento molecular prevê a interação entre a pequena molécula e as proteínas virais.
Para avaliar a influência de drogas em células hospedeiras antes da infecção viral, as células RD de sementes em placas de 12 poços em duas vezes 10 para as quintas células por densidade de revestimento de poços. Incubar as células a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono de 5% durante a noite. Na manhã seguinte, trate cada poço da monocamada RD com um composto de teste de interesse, em triplicado, em concentrações não tóxicas em um mililitro de meio basal por uma ou quatro horas.
Ao final da incubação do tratamento, lave as células com um mililitro de PBS antes de adicionar 50 unidades de formação de placas de vírus em 300 microliters de meio basal por poço por uma hora, com balanço a cada 15 minutos. No final da incubação da infecção, lave as células com PBS e sobreponha as células com um mililitro de meio basal fresco contendo 0,8%de metilcelulose. Após 72 horas na incubadora de cultura celular, lave cada poço com dois mililitros de PBS e fixe as células com 0,5 mililitros de 37% de formaldeído por poço por 15 minutos.
Ao final da fixação, lave os poços com PBS e manche as células com 0,5 mililitros de solução violeta cristalina de 0,5% por poço. Depois de dois minutos, lave os poços com um fluxo suave de água e deixe a placa secar. Em seguida, coloque a placa em uma caixa de luz branca para contar e calcule a porcentagem de células infectadas por coxsackievirus de acordo com a fórmula.
Para análise de acoplamento molecular, baixe moléculas 3D dos compostos de teste do PubChem. Se uma molécula não tiver uma estrutura 3D carregada, baixe a estrutura 2D ou use a sequência de cordas SMILE para transformar a estrutura em uma molécula 3D através de um programa molecular apropriado. Em seguida, baixe uma unidade de montagem biológica viral do RCSB Protein Data Bank.
Usando um programa de biocompputação adequado, exclua os solventes do arquivo Do Banco de Dados de Proteínas, substitua as cadeias laterais incompletas usando dados da biblioteca rotamer Dunbrack 2010 e adicione hidrogênios e cargas à estrutura como relatado anteriormente. Para encaixar os compostos de teste na unidade de vírus preparada, carregue o arquivo composto de teste na Quimera da Universidade da Califórnia em São Francisco como o ligante e selecione toda a proteína viral preparada como receptor para realizar acoplamento cego. Para acoplamento adicional, confine o local de acoplamento à proteína viral a regiões de interesse derivadas dos resultados de acoplamento cego, reduzindo ainda mais o volume de pesquisa.
Em seguida, carregue o arquivo de acoplamento em um sistema gráfico molecular apropriado para analisar as posições do modo de ligação. Selecione o ligante para encontrar contatos polares do composto para a proteína viral, identificando os contatos polares com a opção de qualquer átomo. Ambas as pequenas moléculas testadas neste experimento representativo, produziram apenas um impacto marginal contra a infectividade coxsackievirus A16, seja no pré-tratamento das células hospedeiras antes da infecção viral ou no tratamento pós-infecção.
Em contraste, as moléculas revogaram eficientemente a infecção em mais de 80% no tratamento de co-adição, sugerindo que os dois compostos são os mais eficazes quando estão simultaneamente presentes com as partículas do vírus na superfície celular hospedeira durante a infecção. A análise de ligação baseada em citometria de fluxo confirma que os dois taninos impediram a entrada de infectividade do coxsackievirus A16, impedindo a ligação de partículas virais às células hospedeiras. O acoplamento molecular dos taninos indica que ambos são previstos para se ligar na região do cânion do pentamer coxsackievirus, logo acima da entrada de bolso que contém o fator bolso e desempenha um papel importante para mediar a ligação de coxsackievirus e a entrada na célula hospedeira.
Nestas projeções superficiais, podem ser observados os resíduos únicos previstos a partir dos contatos polares das pequenas moléculas ao redor da entrada do bolso, com asparagine-85, lysina-257 e asparagine-417 em comum entre os dois taninos. Para o acoplamento molecular, a topologia da proteína viral precisa ser levada em conta ao classificar os quadros de ligação. Experimentos adicionais podem incluir testar a atividade antiviral do composto em vírus recombinantes, com mutações nos aminoácidos descobertos para validar sua importância para a eficácia da droga.
