Este protocolo puede ayudar en el descubrimiento de moléculas pequeñas antivirales potenciales a través de un enfoque basado en mecanismos. El ensayo de tiempo de adición determina en qué paso de la infección la molécula pequeña exhibe su actividad antiviral. El acoplamiento molecular predice la interacción entre la molécula pequeña y las proteínas virales.
Para evaluar la influencia de los fármacos en las células huésped antes de la infección viral, las células de RD de semillas en placas de 12 pozos a dos veces 10 a las quintas células por densidad de revestimiento de pozo. Incubar las células a 37 grados centígrados en una incubadora de dióxido de carbono del 5% durante la noche. A la mañana siguiente, tratar cada pozo de la monocapa RD con un compuesto de prueba de interés, en triplicado, a concentraciones no tóxicas en un mililitro de medio basal durante una o cuatro horas.
Al final de la incubación del tratamiento, lavar las células con un mililitro de PBS antes de añadir 50 unidades de virus formadoras de placas en 300 microlitros de medio basal por pozo durante una hora, con balanceo cada 15 minutos. Al final de la incubación de la infección, lavar las células con PBS y superponer las células con un mililitro de medio basal fresco que contiene 0.8%metilcelulosa. Después de 72 horas en la incubadora de cultivo celular, lavar cada pozo con dos mililitros de PBS y fijar las células con 0,5 mililitros de 37%formaldehído por pozo durante 15 minutos.
Al final de la fijación, lavar los pozos con PBS y manchar las células con 0,5 mililitros de 0,5% de solución violeta cristalina por pozo. Después de dos minutos, lave los pozos con una corriente suave de agua y deje que la placa se seque al aire. A continuación, coloque la placa sobre una caja de luz blanca para contar y calcule el porcentaje de células infectadas por coxsackievirus de acuerdo con la fórmula.
Para el análisis de acoplamiento molecular, descargue moléculas 3D de los compuestos de prueba de PubChem. Si una molécula no tiene una estructura 3D cargada, descargue la estructura 2D o utilice la secuencia de cadenas SMILE para transformar la estructura en una molécula 3D a través de un programa molecular adecuado. A continuación, descargue una unidad de ensamblaje biológico viral de RCSB Protein Data Bank.
Utilizando un programa de biocódica adecuado, elimine los disolventes del archivo Protein Data Bank, reemplace las cadenas laterales incompletas utilizando datos de la biblioteca de rotadores Dunbrack 2010 y agregue hidrógenos y cargas a la estructura como se informó anteriormente. Para acoplar los compuestos de prueba en la unidad de virus preparada, cargue el archivo compuesto de prueba en la Quimera de la Universidad de California en San Francisco como ligando y seleccione toda la proteína viral preparada como receptor para realizar el acoplamiento ciego. Para un acoplamiento adicional, limite el sitio de acoplamiento a la proteína viral a regiones de interés derivadas de los resultados de acoplamiento ciego reduciendo aún más el volumen de búsqueda.
A continuación, cargue el archivo de acoplamiento en un sistema de gráficos moleculares adecuado para analizar las posiciones del modo de enlace. Seleccione el ligando para encontrar contactos polares desde el compuesto a la proteína viral, identificando los contactos polares con la opción de a cualquier átomo. Ambas moléculas pequeñas probadas en este experimento representativo, sólo produjeron un impacto marginal contra la infectividad del coxsackievirus A16, ya sea en el pretratamiento de las células huésped antes de la infección viral o en el tratamiento posterior a la infección.
Por el contrario, las moléculas derogaron eficientemente la infección en más del 80% en el tratamiento de co-adición, lo que sugiere que los dos compuestos son los más eficaces cuando están presentes simultáneamente con las partículas del virus en la superficie de la célula huésped durante la infección. El análisis de unión basado en la citometría de flujo confirma que los dos taninos previnieron la entrada de infectividad del coxsackievirus A16 al impedir la unión de partículas virales a las células huésped. El acoplamiento molecular de los taninos indica que ambos se prevé que se adhi inicien en la región del cañón del pentámero del coxsackievirus, justo por encima de la entrada de bolsillo que contiene el factor de bolsillo y desempeña un papel importante para mediar en la unión al coxsackievirus y la entrada en la célula huésped.
En estas proyecciones superficiales, se pueden observar los residuos únicos predichos a partir de los contactos polares de las pequeñas moléculas alrededor de la entrada de bolsillo, con asparagina-85, lisina-257, y asparagina-417 en común entre los dos taninos. Para el acoplamiento molecular, la topología de la proteína viral debe tenerse en cuenta al clasificar los marcos de unión. Experimentos adicionales podrían incluir la prueba de la actividad antiviral del compuesto en virus recombinantes, con mutaciones en los aminoácidos descubiertos para validar su importancia a la eficacia del fármaco.
