이 프로토콜은 메커니즘 중심의 접근 방식을 통해 잠재적 인 항 바이러스 소 분자의 발견에 도움이 될 수 있습니다. 추가 분석의 시간은 소분자가 항바이러스 활성을 나타내는 감염의 어느 단계를 결정한다. 분자 도킹은 소분자와 바이러스 성 단백질 사이의 상호 작용을 예측합니다.
바이러스 감염 전에 숙주 세포에 대한 약물의 영향을 평가하기 위해, 12웰 플레이트에서 12웰 플레이트에서 잘 도금 밀도당 다섯 번째 세포에 10번 종자 RD 세포. 하룻밤 사이에 5%의 이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 세포를 배양합니다. 다음 날 아침, RD 단층의 각 우물을 관심 있는 시험 화합물로 치료하여, 삼중항에, 1~4시간 동안 기저 배지의 1밀리리터에서 무독성 농도로 치료한다.
치료 인큐베이션이 끝나면 15 분마다 흔들리면서 1 시간 동안 잘 기초 매체 의 300 마이크로 리터에 50 개의 플라크 형성 유닛을 추가하기 전에 PBS의 1 밀리리터로 세포를 씻으면 됩니다. 감염 인큐베이션의 끝에서, PBS로 세포를 세척하고 0.8 %의 메틸 셀룰로오스를 포함하는 신선한 기저 배지의 1 밀리리터로 세포를 오버레이. 세포 배양 인큐베이터에서 72 시간 후, PBS의 두 밀리리터로 각각 잘 씻고 15 분 동안 잘 37 %의 37 %의 포름알데히드의 0.5 밀리리터로 세포를 고정하십시오.
고정의 끝에서, PBS로 우물을 세척하고 우물 당 0.5 %의 0.5 밀리리터로 세포를 얼룩. 2분 후, 우물을 부드러운 물 줄기로 씻고 접시가 건조하게 하십시오. 그런 다음 계산을 위해 백색광 상자에 접시를 놓고 수식에 따라 coxsackievirus 감염된 세포의 백분율을 계산합니다.
분자 도킹 분석을 위해 PubChem에서 테스트 화합물의 3D 분자를 다운로드하십시오. 분자가 업로드된 3D 구조가 없는 경우, 2D 구조를 다운로드하거나 SMILE 문자열 서열을 사용하여 적절한 분자 프로그램을 통해 구조를 3D 분자로 변환한다. 다음으로 RCSB 단백질 데이터 뱅크에서 바이러스 성 생물학적 조립 장치를 다운로드하십시오.
적절한 바이오 컴퓨팅 프로그램을 사용하여 단백질 데이터 뱅크 파일에서 용매를 삭제하고, 던브랙 2010 로타머 라이브러리의 데이터를 사용하여 불완전한 측면 체인을 교체하고 이전에 보고된 대로 구조에 수소와 충전을 추가합니다. 시험 화합물을 준비된 바이러스 장치에 도킹하려면, 캘리포니아 샌프란시스코 키메라 대학에 시험 화합물 파일을 리간드로 업로드하고 블라인드 도킹을 수행하기 위해 수용체로서 준비된 전체 바이러스 단백질을 선택한다. 추가 도킹의 경우, 도킹 부위를 검색량을 더욱 감소시킴으로써 맹목적인 도킹 결과로부터 파생된 관심 영역으로 바이러스 성 단백질에 제한한다.
그런 다음 도킹 파일을 적절한 분자 그래픽 시스템에 업로드하여 바인딩 모드 위치를 분석합니다. 리간드를 선택하여 화합물에서 바이러스 성 단백질까지 극성 접접촉을 찾아 원자 옵션과의 극성 접접촉을 식별합니다. 이 대표적인 실험에서 시험된 두 개의 작은 분자는, 바이러스 감염 전 또는 감염 후 처리에서 숙주 세포의 전처리에서 든 coxsackievirus A16 감염성에 대하여 한계 충격을 생성했습니다.
대조적으로, 분자는 공동 추가 처리에서 80% 이상 에 의하여 감염을 효율적으로 제거했습니다, 2개의 화합물이 감염 도중 호스트 세포 표면에 바이러스 입자와 동시에 존재할 때 가장 효과적이다는 것을 건의합니다. 유동 세포측정 기반 결합 분석은 두 탄닌이 숙주 세포에 바이러스 입자 결합을 방지함으로써 coxsackievirus A16 감염성 진입을 방지함을 확인합니다. 탄닌의 분자 도킹은 둘 다 포켓 팩터를 잡고 coxsackievirus 바인딩 및 호스트 세포로의 입력을 중재하는 중요한 역할을 하는 포켓 입구 바로 위에 coxsackievirus pentamer의 협곡 지역에 결합할 것으로 예상된다는 것을 나타냅니다.
이러한 표면 투영에서, 포켓 입구 주변의 소분자의 극성 접촉으로부터 예측된 독특한 잔류물은 아스파라진-85, 리신-257 및 아스파라진-417을 두 탄닌 사이에 공통적으로 관찰할 수 있다. 분자 도킹의 경우, 결합 프레임을 순위를 매일 때 바이러스 성 단백질의 토폴로지가 고려되어야합니다. 추가 실험은 재조합 바이러스에 화합물의 항 바이러스 활성을 테스트 포함 될 수 있습니다., 아미노산에 돌연변이 약물의 효능에 그들의 중요성을 확인 하기 위해 발견.
