利用病毒进入检测和分子对接分析鉴定抗病毒候选药物,对抗Coxsackie病毒A16

该协议可以通过机制驱动的方法帮助发现潜在的抗病毒小分子。补充检测的时间决定了小分子在感染的哪个步骤表现出其抗病毒活性。分子对接预测小分子和病毒蛋白之间的相互作用。

为了评估药物在病毒感染之前对宿主细胞的影响，在12孔板中以每井电镀密度的2倍10至第五细胞为种子RD细胞。在5%的二氧化碳培养箱中孵育细胞在37摄氏度下过夜。第二天早上，用三氧化碳的试验化合物，在一毫升基底介质中以无毒浓度处理 RD 单层的每一个井，为期一到四个小时。

在治疗孵化结束时，用1毫升PBS清洗细胞，然后在每井300微升基基中加入50个斑块形成单位的病毒，每井1小时，每15分钟摇动一次。在感染孵育结束时，用PBS清洗细胞，用含有0.8%甲基纤维素的一毫升新鲜基底介质覆盖细胞。在细胞培养培养箱中72小时后，用两毫升PBS清洗每井，用每井37%甲醛的0.5毫升固定细胞15分钟。

在固定结束时，用PBS清洗孔，用每孔0.5毫升的0.5%水晶紫罗兰溶液染色细胞。两分钟后，用温和的水流清洗水井，让盘子风干。然后将板放在白灯盒上，用于计数，并根据公式计算感染的考克斯病毒细胞的百分比。

有关分子对接分析，请从 PubChem 下载测试化合物的 3D 分子。如果分子没有上传 3D 结构，请下载 2D 结构或使用 SMILE 字符串序列通过适当的分子程序将结构转换为 3D 分子。接下来，从RCSB蛋白质数据库下载病毒生物组装单元。

使用适当的生物计算程序，从蛋白质数据库文件中删除溶剂，使用 Dunbrack 2010 Rotamer 库的数据替换不完整的侧链，并像先前报告的结构中添加氢气和电荷。要将测试化合物停靠到准备好的病毒单元上，请将测试化合物文件上传到加州大学旧金山奇美拉分校作为配体，并选择整个准备好的病毒蛋白作为受体进行盲对接。对于额外的对接，请通过进一步减小搜索量，将对接站点限制在病毒蛋白上，以关注从盲对接结果中得出的感兴趣区域。

然后将对接文件上传到适当的分子图形系统中，以分析绑定模式的位置。选择配体以查找从化合物到病毒蛋白的极性接触，确定具有任何原子选项的极性接触。在这个具有代表性的实验中测试的两个小分子，无论是病毒感染前的宿主细胞的预处理，还是感染后治疗，都只对考克斯克病毒 A16 感染产生轻微的影响。

相比之下，分子在结合治疗中有效消退了80%以上的感染，这表明，当两种化合物在感染过程中与宿主细胞表面的病毒颗粒同时出现时，它们最有效。基于流细胞学的结合分析证实，两种单宁通过防止病毒颗粒与宿主细胞结合，防止了囊录病毒 A16 感染性进入。单宁的分子对接表明，它们都预测在考克斯克病毒五角细胞的峡谷区域结合，就在口袋入口的正上方，持有口袋因子，对调节考克斯病毒结合和进入宿主细胞起着重要作用。

在这些表面投影中，可以观察到口袋入口周围小分子的极性接触中预测的独特残留物，其中芦笋-85、莱辛-257和芦笋-417是两个单宁之间的共同值。对于分子对接，在对结合帧进行排名时，需要考虑病毒蛋白的拓扑结构。其他实验可能包括测试化合物在重组病毒上的抗病毒活性，对氨基酸进行突变，以验证其对药物疗效的重要性。