このプロトコルは、メカニズム主導のアプローチを通じて潜在的な抗ウイルス小分子の発見を助けることができる。加算アッセイの時点では、その低分子が抗ウイルス活性を示す感染のステップを決定する。分子ドッキングは、小分子とウイルスタンパク質の相互作用を予測します。
ウイルス感染前の宿主細胞に対する薬物の影響を評価するために、RD細胞を12ウェルプレートに2倍10~5番目の細胞で播種した。一晩で5%の二酸化炭素インキュベーターで37°Cで細胞をインキュベートします。翌朝、RD単層の各ウェルを目的とする試験化合物で、三重化で、1ミリリットルの基底培地中の非毒性濃度で1〜4時間治療する。
治療インキュベーションの最後に、PBSの1ミリリットルで細胞を洗浄してから、1時間あたり300マイクロリットルの基底培地に50個のプラーク形成単位のウイルスを加え、15分ごとに揺れ動かします。感染インキュベーションの終わりに、PBSで細胞を洗浄し、0.8%メチルセルロースを含む新鮮な基礎培地の1ミリリットルで細胞をオーバーレイします。細胞培養インキュベーターで72時間後、PBSを2ミリリットルでそれぞれよく洗い、15分間37%ホルムアルデヒドの0.5ミリリットルで細胞を固定します。
固定の終わりに、PBSでウェルを洗浄し、ウェルあたり0.5%クリスタルバイオレット溶液の0.5ミリリットルで細胞を汚します。2分後、井戸を穏やかな水で洗い、プレートを空気乾燥させます。次に、プレートを数えるために白いライトボックスに置き、式に従ってコクサッキーウイルス感染細胞の割合を計算します。
分子ドッキング解析では、PubChemから試験化合物の3D分子をダウンロードしてください。分子にアップロードされた3D構造がない場合は、2D構造をダウンロードするか、またはSMILE文字列シーケンスを使用して、適切な分子プログラムを介して構造を3D分子に変換します。次に、RCSBタンパク質データバンクからウイルス生物学的組み立てユニットをダウンロードします。
適切なバイオコンピューティングプログラムを使用して、タンパク質データバンクファイルから溶媒を削除し、Dunbrack 2010ロタマーライブラリからのデータを使用して不完全な側鎖を交換し、前述のように水素と電荷を構造に追加します。テスト化合物を準備されたウイルスユニットにドッキングするには、テスト化合物ファイルをリガンドとしてカリフォルニア大学サンフランシスコキメラ校にアップロードし、ブラインドドッキングを行う受容体として調製されたウイルスタンパク質全体を選択します。追加のドッキングの場合、さらに検索量を減らすことによって、ブラインドドッキング結果から得られる対象領域にドッキング部位をウイルスタンパク質に閉じ込めます。
次に、ドッキングファイルを適切な分子グラフィックスシステムにアップロードして、結合モードの位置を分析します。リガンドを選択して化合物からウイルスタンパク質への極性接触を見つけ、任意の原子に対する極性接触を識別します。この代表的な実験で試験された小分子の両方は、ウイルス感染前の宿主細胞の前処理でも感染後の治療においても、コクサッキーウイルスA16感染に対する限界的な影響のみを生み出した。
対照的に、分子は共加処理において80%を超えて効率的に感染を除去し、感染時に宿主細胞表面にウイルス粒子と同時に存在する場合に2つの化合物が最も効果的であることを示唆している。フローサイトメトリーに基づく結合分析は、2つのタンニンが宿主細胞へのウイルス粒子結合を防止することによってコクサッキーウイルスA16感染性エントリーを予防したことを確認する。タンニンの分子ドッキングは、両方ともコクサッキーウイルスペンタマーの峡谷領域で結合すると予測されていることを示し、ポケットファクターを保持し、コクサッキーウイルスの結合および宿主細胞への侵入を仲介する上に重要な役割を果たす。
これらの表面投影では、2つのタンニンの間で共通のアスパラギン-85、リジン-257、およびアスパラギン-417で、ポケット入り口の周りの小分子の極性接点から予測されるユニークな残基が観察される。分子ドッキングの場合、結合フレームをランク付けする際にウイルスタンパク質のトポロジーを考慮する必要があります。追加の実験には、組み換えウイルスに対する化合物の抗ウイルス活性のテストが含まれ、薬物の有効性に対する重要性を検証するために発見されたアミノ酸の突然変異が含まれる。
