Этот протокол может помочь в открытии потенциальных противовирусных малых молекул с помощью подхода, управляемого механизмом. Время дополнительного анализа определяет, на каком этапе инфекции небольшая молекула проявляет свою противовирусную активность. Молекулярная стыковка предсказывает взаимодействие между маленькой молекулой и вирусными белками.
Для оценки влияния наркотиков на клетки-хозяина до вирусной инфекции, семенные RD-клетки в 12-хорошо пластин в два раза от 10 до пятой клетки на плотность покрытия хорошо. Инкубировать клетки при 37 градусах по Цельсию в инкубаторе двуокиси 5%углерода в одночасье. На следующее утро, лечить каждый колодец RD монослой с испытательным соединением интереса, в тройном, в нетоксичных концентрациях в одном миллилитре базальной среды в течение одного или четырех часов.
В конце инкубации лечения, мыть клетки с одним миллилитров PBS перед добавлением 50 бляшек формирования единиц вируса в 300 микролитров базальной среды на колодец в течение одного часа, с качания каждые 15 минут. В конце инкубации инфекции, мыть клетки с PBS и наложить клетки с одним миллилитр свежей базальной среды, содержащей 0,8%метилцеллюлозы. После 72 часов в инкубаторе культуры клетки, мыть каждый хорошо с двумя миллилитров PBS и исправить клетки с 0,5 миллилитров 37%формальдегида на колодец в течение 15 минут.
В конце фиксации, мыть скважины с PBS и пятно клеток с 0,5 миллилитров 0,5%кристалл фиолетовый раствор на скважину. Через две минуты промойте колодцы нежным потоком воды и дайте пластине высохнуть. Затем поместите пластину на белую световую коробку для подсчета и расчета процента коксакивируса инфицированных клеток в соответствии с формулой.
Для молекулярного стыковочного анализа загрузите 3D-молекулы тестовых соединений из PubChem. Если молекула не имеет загруженной 3D-структуры, загрузите 2D-структуру или используйте последовательность струн SMILE для преобразования структуры в 3D-молекулу с помощью соответствующей молекулярной программы. Далее загрузите вирусную биологическую сборочную единицу из RCSB Protein Data Bank.
Используя соответствующую программу био-вычислений, удалите растворители из файла Банка данных protein, замените неполные боковые цепочки, используя данные из библиотеки ротамеров Dunbrack 2010, и добавьте водород и заряды в структуру, как сообщалось ранее. Чтобы пристыковать тестовые соединения к подготовленному вирусному блоку, загрузите файл соединения теста в Калифорнийский университет Сан-Франциско Химера в качестве лиганда и выберите весь подготовленный вирусный белок в качестве рецептора для выполнения слепой стыковки. Для дополнительной стыковки ограничьь место стыковки вирусным белком в области, представляющие интерес, полученные в результате слепой стыковки, путем дальнейшего сокращения объема поиска.
Затем загрузите файл стыковки в соответствующую молекулярную графику для анализа позиций режима связывания. Выберите лиганд, чтобы найти полярные контакты от соединения до вирусного белка, идентифицирует полярные контакты с любым вариантом атомов. Обе небольшие молекулы, протестированные в этом репрезентативном эксперименте, только произвели незначительное воздействие против coxsackievirus A16 инфекционности, будь то в предварительной обработке клеток-хозяй до вирусной инфекции или в постинфекционом лечении.
В отличие от этого, молекулы эффективно отменены инфекции более чем на 80% в совместное дополнение лечения, предполагая, что два соединения являются наиболее эффективными, когда они одновременно присутствуют с частицами вируса на поверхности клетки-хозяина во время инфекции. Цитометрия потока на основе связывания анализа подтверждает, что два танина предотвратить coxsackievirus A16 инфекционное вступление путем предотвращения вирусных частиц связывания с клетками-хозяинами. Молекулярная стыковка танинов указывает на то, что они оба предсказал связывать в каньоне области coxsackievirus pentamer, чуть выше карманного входа, который держит карманный фактор и играет важную роль для посредничества coxsackievirus связывания и вступления в клетку-хозяина.
В этих поверхностных проекциях можно наблюдать уникальные остатки, предсказанные полярными контактами малых молекул вокруг карманного входа, с аспарагином-85, лизином-257 и аспарагином-417, общими между двумя танинами. Для молекулярной стыковки при ранжирование связывающих кадров необходимо учитывать топологию вирусного белка. Дополнительные эксперименты могут включать тестирование противовирусной активности соединения на рекомбинантных вирусах, с мутациями на аминокислотах, обнаруженных для подтверждения их важности для эффективности препарата.
