A proliferação é uma medida importante da função celular. Este protocolo permite que os investigadores desenvolvam um ensaio de proliferação sensível em seus laboratórios sem o alto custo de kits disponíveis comercialmente. A principal vantagem dessa técnica é que evita o tratamento severo das células e/ou o uso de radioatividade.
Demonstrando essa técnica será Vicky Wong, a gerente do meu laboratório. Para avaliar a proliferação, remova as células musculares lisas vasculares de um frasco com mediação celular muscular lisa em soro bovino fetal de 2% e placa a 20.000 células por mililitro em DMEM em uma placa de 96 poços. Cresça as células a 37 graus Celsius durante a noite.
Adicione 30 nanogramas por mililitro de fator de crescimento derivado de plaquetas a três a seis poços como um controle positivo para estimular a proliferação. Em seguida, adicione PBS ao mesmo número de poços que um controle negativo. Incubar por 72 horas.
Diluir previamente preparado cinco milimões EdU estoque para um mililitro e adicionar dois microliters a cada poço para as últimas 24 horas do período de cultura de 72 horas. Mantenha um conjunto de réplicas sem EdU para determinar fluorescência de fundo e luminescência. Vinte e quatro horas depois, conserte as células removendo a mídia, adicionando 150 microliters por poço de 4% de paraformaldeído e incubar 10 minutos à temperatura ambiente.
Remova o paraformaldeído e adicione 150 microliters de 1%TX-100 em água por poço e incubar em temperatura ambiente por 30 minutos. Lave três vezes com PBS para remover o TX-100. Para detectar EdU incorporado usando fluorescência, fazer 10 mililitros de solução de rotulagem por placa de 96 poços pouco antes de usar adicionando reagentes de soluções de estoque na ordem certa:20 microliters THPTA, 20 microliters sulfato de cobre, cinco microliters fluoresceína picolyl-azide, e 100 microliters sódio ascorbate em PBS para um volume total de 10 mililitros.
O passo mais crítico é fazer a solução de rotulagem pouco antes de ser usada. Remova o PBS dos poços, adicione 150 microliters de solução de rotulagem a cada poço e incuba 30 minutos a 37 graus Celsius. Para detectar todos os núcleos, adicione DAPI a cada poço e imagem em um microscópio fluorescente ou leitor de placas de imagem.
Para evitar a contagem manual e quando um leitor de placa de imagem não estiver disponível, este protocolo pode ser modificado para uma leitura de luminescência usando azida HRP e um substrato ELISA. Para detectar EdU usando luminscência, primeiro prepare o soro fisiológico com 0,1% de polisorbato 20. Em seguida, adicione 150 microliters de tampão de bloqueio a cada poço e incubar por 90 minutos em temperatura ambiente.
Depois de remover o tampão de bloqueio, lave as células três vezes com 200 microliters de PBS. Para detectar a EdU incorporada, primeiro prepare 10 mililitros de solução de rotulagem por placa de 96 poços adicionando reagentes de soluções de estoque na ordem certa. Primeiro, 20 microliters THPTA, depois 20 microliters sulfato de cobre, cinco microliters biotin picolyl-azide, 100 microliters ascorbate de sódio em PBS para um volume total de 10 mililitros.
Lave os poços cinco vezes três minutos com 200 microliters de TBST com agitação. Sacie peroxidases endógenas com 150 microlitres de 0,3% de peróxido de hidrogênio por 20 minutos à temperatura ambiente. Depois de remover peróxido de hidrogênio, lave cinco vezes três minutos com 200 microliters de TBST com agitação.
Adicione 50 microliters de peroxidase de streptavidin-rabanete diluído em TBST a cada poço e incubar à temperatura ambiente por uma hora. Lave cinco vezes três minutos com 200 microliters de TBST com agitação. Adicione 50 microliters de substrato ELISA quemiluminescente a cada poço e leia imediatamente em um leitor de placas capaz de detectar luminescência.
Embora os núcleos fluorescentes possam ser detectados por um leitor de placas de fluorescência padrão, usando o protocolo de luminescência, a varredura fluorescente é convertida em uma leitura líquida homogênea detectada com peroxidase de rabanete streptavidin-rabídiche e um substrato ELISA padrão. A vantagem deste método em comparação com uma leitura fluorescente é uma leitura mais homogênea e a placa pode ser lida em segundos, como visto aqui quando a proliferação do VSMC em resposta ao PDGF foi medida. A desvantagem é que o fundo é maior do que com fluorescência, portanto, controles negativos tendem a ser maiores.
Na tentativa de diminuir a variabilidade, os resultados foram normalizados para a contagem inicial de células. No entanto, em um conjunto separado de experimentos, foi demonstrado que este método não é sensível o suficiente para detectar pequenas diferenças nos números de células. A maneira mais eficiente e precisa de contar células positivas e totais da EdU é usando um leitor de placas de imagem.
Se este tipo de leitor de placa não estiver disponível, a contagem manual também produzirá resultados precisos. Ao comparar esses dois métodos, a contagem manual positiva da EdU foi idêntica à contagem automatizada, assim como a contagem total não estimulada. A vantagem desses dois métodos é a visibilidade das células a serem contadas, melhor precisão, e que a coloração inespecífica dos detritos pode ser vista e evitada.
A principal desvantagem com o método de contagem manual é o tempo. Lembre-se de fazer a solução de rotulagem fresca pouco antes de usar e adicionar os ingredientes na ordem fornecida no protocolo escrito. Se a intensidade da coloração for fraca, tente ajustar a relação quelador para cobre.
Lembre-se que o paraformaldeído é tóxico. Deve ser usado em um capuz de fumaça enquanto usa luvas. O procedimento em si não é difícil, mas pode precisar ser otimizado ajustando as relações chelator para cobre na solução de rotulagem.
Além disso, os tempos de incubação e o comprimento do tratamento da EdU podem ser ajustados dependendo do tipo celular e da pergunta específica que está sendo feita. Esta técnica é compatível com a superfície celular e coloração intracelular para que as características das células divisórias e não-divisórias possam ser determinadas. Embora comumente usado para medir a proliferação, a química de cliques também pode ser usada para a rotulagem metabólica de RNA, proteínas, ácidos graxos e carboidratos.
Se o alvo metabólico de interesse estiver na superfície celular, as células vivas podem ser rotuladas.
