Wellcome Trust forneceu apoio financeiro (Prêmio VIP para JSY e 074128 Bolsa de Investigação para KLB). Conselho de Pesquisa Médica Studentship para RJA Leica_SP2_Stacker, um algoritmo usado para importar TIFFs para &#39;reconstrução&#39; em uma série, é baseado em Leica_tiff_sequence, um plugin para ler Leica SP2 TIFFs no ImageJ, desenvolvido por Tony Collins e usado com sua permissão. ( <a href="http://www.uhnres.utoronto.ca/facilities/wcif/software/Plugins/LeicaTIFF.html">http://www.uhnres.utoronto.ca/facilities/wcif/software/Plugins/LeicaTIFF.html</a> ) StackReg e TurboReg, algoritmos utilizados para corrigir o movimento do tecido, são baseados em Th venaz e colegas (1998) 9. Excel_writer.jar foi escrito por Kurt De Vos (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/excel-writer.html). JNCT0.08JoVE.ijm, o algoritmo de detecção de partículas, é baseado em um algoritmo escrito por Cérebro KL e detalhado anteriormente 5.

Parte 1: Preparação do Ca 2 + indicador (Oregon Verde 488-BAPTA 01:00) <ol><li> Oregon Verde 488-BAPTA 01:00 vem em frascos de 500 mL de uma pequena quantidade (50 mg) de pó. Adicionar 40 mL PLURONIC F-127 solução para o pó, agitando suavemente durante 30 s, em seguida, adicione 460 mL PSS, e agitar suavemente por 30 s. A solução final, 10 mM Oregon Verde 488 BAPTA-01:00, fornece 4 x 125 mL alíquotas. Evitar a exposição à luz e armazenar a -20 C. </li></ol> Parte 2: Ca 2 + carga <ol><li> Remover o Ca 2 + indicador (Oregon Verde 488-BAPTA 01:00) a partir do freezer (-20 C) e deixar descongelar em temperatura ambiente. </li><li> Tomar 1 ml de PSS em um tubo de ensaio e coloque em banho-maria. Bolha com 95% O 2 / 5% CO 2 a uma taxa de cerca de 1 bolha aparecendo por segundo. O borbulhador precisa ser protegido em tubo de ensaio, por exemplo, com uma rolha ou com Parafilm. </li><li> Dissecar os tecidos do animal e, em uma placa de Petri Sylgard-alinhado, remova cuidadosamente tecido conjuntivo. Independentemente do tipo de músculo liso do órgão, PSS deve ser substituído a cada 10 minutos e tecidos devem ser bem lavados (por exemplo, substituindo o PSS três vezes) dissecção seguinte. Para o canal deferente: considerar cortar o órgão de comprimento maneiras de produzir uma folha de tecido. Para a bexiga urinária: aberto longitudinalmente a partir do colo da bexiga (posterior) para o topo da cúpula (anterior). Prepare quatro tiras, 6-8 mm de comprimento e 1-2 mm de largura, ao longo da superfície dorsal do detrusor, o corte na direção dos feixes musculares dominante. </li><li> Lugar dissecados tecido na &quot;pré-aquecida e com bolhas &#39;PSS. </li><li> Adicionar 125 mL de 10 mM Oregon Verde 488-BAPTA 01:00 de tubo de ensaio e dar um pouco agitação, à mão, para misturar. </li><li> Retomar a borbulhar e deixe, coberto com papel alumínio. O tempo necessário para o tecido suficiente para assumir o Ca 2 + indicador varia de acordo com o tamanho do tecido ea espessura da camada de músculo liso. Por exemplo: 70 mins (mouse detrusor, anococcygeus rato) a 120 minutos (detrusor de rato vas, deferente do rato). </li></ol> Parte 3: Preparando o &#39;Ca 2 + carregado&#39; de tecidos para microscopia Cuidado pinagem do tecido é necessário para minimizar o movimento espontâneo do tecido (a propriedade de imagem de células musculares lisas do tecido relativamente intacta) e para facilitar a localização de um local adequado para geração de imagens (como um pedaço de tecido pode ser pesquisados ​​em duas dimensões, em vez de três). <ol><li> Lave o tecido em PSS borbulhava por pelo menos 5 minutos. </li><li> Montagem em Sylgard alinhadas prato preparação, alongamento do tecido (um pouco) para formar uma folha plana. Evite a utilização de &#39;pins&#39; que podem riscar o objetivo, uso comprimentos curtos, em vez de 25-50 fio de prata mM diâmetro como &#39;pinos&#39; e inserir em um ângulo. </li><li> Posicione o prato preparação no estágio do microscópio, tomando cuidado para assegurar que o PSS não escapa da área Sylgard-alinhados do prato (como isso pode levar a uma grande área a ser coberta no PSS, quando o superfusão começa). </li><li> Ligue a bomba, a fim de superfuse a preparação com PSS. A taxa de 100 ml por hora é freqüentemente empregada. </li><li> Ligar o aparelho aquecedor. </li><li> Coloque os tubos de entrada e saída e sonda de temperatura no prato preparação (aposição cada um para a tira de metal pelo ímã em sua base). A altura da ponta do tubo de saída irá determinar a profundidade do PSS. Tenha cuidado para garantir que a saída é realmente remover PSS (como às vezes não inicialmente). </li><li> Regule a temperatura do aquecedor na unidade para atingir a temperatura desejada, por exemplo, 33-35 C. </li><li> Permitir que o tecido a estabilizar durante pelo menos 10 minutos. </li></ol> Parte 4: Selecção do local para a imagem Exposição à iluminação de excitação vai photobleach o indicador, portanto evite usar por mais de alguns segundos de cada vez. <ol><li> Com um objectivo de baixa potência (10x ou 20x) uso de epifluorescência, emocionante, com uma luz azul, para ver o músculo liso e identificar uma região adequada para monitor. Tente escolher um site baseado em: movimento (que deve ser mínima) eo número de células musculares lisas no campo. &quot;Estruturas&quot; brilhante pode causar um elevado número de &quot;falsos positivos&quot; no algoritmo de detecção de imagem, de modo a evitar sites com grande número de (ex) intercaladas células epiteliais ou fibroblastos. </li><li> Mudar para um objetivo maior potência (40x). </li><li> Gire o palco ou o eixo óptico para que a célula muscular lisa (s) está horizontal (paralela ao eixo ie varredura rápida). </li></ol> Parte 5: A microscopia confocal Os detalhes de como o microscópio confocal é &#39;set up&#39; são específicos para cada tipo de microscópio, masas principais considerações são: velocidade (mínimo de 5 Hz é necessária para a maioria dos transientes de Ca 2 +), a resolução e tamanho de campo (os quais são negociados-off com a velocidade). Alguns dos seguinte protocolo é específico para um SP2 Leica microscópio confocal ereta. Um protocolo típico é: 100 séries de quadros, adquiridos a 5 Hz (256 x 256 pixels; aproximadamente 100 x 100 mm.) Ou 13,5 Hz (256 x 64 pixels; aprox 100 x 25 mm.). A cabeça de leitura definido para mover bi-direcional (para maximizar a velocidade de aquisição) e adquirir a 1000 Hz por linha. <ol><li> Fechar o pinhole para um &quot;disco arejado. </li><li> Definir a potência do laser (488 nm) entre 25 e 35% sobre o AOTF; este valor é um trade-off entre o brilho eo fotobranqueamento. (O último a ser um problema em particular durante as gravações de comprimento.) </li><li> Adquirir seis séries por site, e 4-6 sítios por &#39;tratamento&#39;. É comum a finalidade de monitorar os mesmos seis sítios pré-droga (&quot;controle&quot;, por exemplo) e pós-droga, embora fotobranqueamento significativas pode causar o experimentador a desviar-se disso. </li><li> É essencial com Ca 2 + imagem que &quot;controla o tempo&quot; são executadas. </li></ol> Parte 6: Preparação para a análise <ol><li> Baixe e instale J Imagem de: http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html. Baixe a versão específica da plataforma, e então atualizar para a versão mais recente baixando o arquivo mais recente imageJ.jar de http://rsb.info.nih.gov/ij/upgrade/ij.jar, substituindo o arquivo antigo. Utilizadores da Apple Mac: se ele é executado lentamente, certifique-se que você está usando a versão mais recente do Java Virtual Machine (JVM) disponível a partir de Apple (http://www.apple.com/macosx/features/java/). </li><li> Download Excel_writer.jar de: http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/excel-writer.html e instalar na Plugins [diretório] diretório jar&gt;. </li><li> Copie os seguintes arquivos no diretório Plugins: Leica_SP2_Stacker.class; JNCT0.08Release.ijm. Instalar cada um desses scripts usando o Plugins [Menu]&gt; Macros&gt; Instale ... função do ImageJ. </li><li> Nós usamos uma Leica SP2 microscópio confocal, o software (Leica LCS) para que gera cada série como um único &quot;filme&quot; visível dentro do software, mas economiza como quadros individuais. Para reconstruir quadros em série: (i) Certifique-se que todos os &#39;frames&#39; de ser reconstruído estão em uma única pasta (por exemplo &#39;DataFolder&gt; Tiffs&#39;). (Ii) Selecione Plugins [Menu]&gt; Macros&gt; Leica_SP2_Stacker. Selecione o diretório raiz (por exemplo &#39;DataFolder&#39;). Selecione a pasta desejada na lista drop-down (&quot;Tiffs / &#39;, por exemplo). Selecione um diretório de saída ou gerar uma nova (&quot;DataFolder&gt; Stacks &#39;, por exemplo). O script será então reconstruir série de quadros individuais. </li></ol> Parte 7: Correção para o movimento Embora o movimento do site com imagens podem ser minimizados com a fixação boa e tecido uniformemente esticada, alguns órgãos do músculo liso apresentam contrações espontâneas que não pode ser abolido pelo cuidado pinagem sozinho. Aqui nós descrevemos o uso de um algoritmo livremente disponível que alinha ou fósforos frames dentro de uma série. <ol><li> Download &#39;StackReg &quot;(http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) e&#39; TurboReg&quot; (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/). </li><li> Instale cada um para o diretório Plugins utilizando o Plugins&gt; Macros&gt; Instale ... </li><li> Coloque uma pilha para ser processado (File&gt; Open ...) e depois passar para um quadro que mostra claramente o campo de interesse. Outros quadros serão alinhados a este quadro de referência. </li><li> Plugins&gt; Pilhas&gt; StackReg. Tente cada um dos diferentes &quot;Transformações&quot; (tradução, corpo rígido, rotação Scaled, Affine) para determinar o que é mais eficaz. (Mais detalhes: http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) </li></ol> Parte 8: algoritmo de detecção de partículas Para cada &#39;site&#39; com imagens, os fatores variarão que afetam a detecção de transientes de Ca 2 +. Ao medir certas propriedades de cada site (&quot;parâmetros de partículas&quot; - abaixo detalhada), o processo de detecção é facilitada. Assim, para cada local, calcula-se &quot;limite para subtraído&quot;, &quot;limite para a relação&quot; e &quot;limiar limite da célula. <ol><li> Plugins [Menu]&gt; Macros&gt; Instalar ... e selecione &#39;JNCT0.08Release.ijm&#39;. </li><li> Plugins [Menu]&gt; Macros pilha de carga&gt; (atalho: l). Selecionar uma série de partículas e calcular parâmetros: <ol style="list-style:none;"><li> a. Limiar para subtraído (fundo =) </li></ol></li><li> Selecione um ROI retangular sobre o que você acredita ser &#39;background&#39;. </li><li> Medida (atalho: m). Anote MEAN. <ol style="list-style:none;"><li> b. Limite de cálculo para o rácio </li></ol></li><li> Selecione um retangularROI em torno de uma área plana opticamente da célula (s). </li><li> Medida (atalho: m). Nota DESVIO baixo médio e padrão. </li><li> Repita mais duas vezes, ou você pode desenhar três caixas de uma vez pressionando &#39;Shift&#39;. </li><li> Calcular e anotar limite para a relação = (1 + SD / média) x 32, com média de valores das três repetições / sites. <ol style="list-style:none"><li> c. Limiar limite da célula </li></ol></li><li> Image&gt; Pilhas&gt; Z projeto ... Escolha o tipo de projeção: &#39;intensidade média&#39; </li><li> Image&gt; Adjust&gt; Limiar. </li><li> Selecione em preto e branco. </li><li> Definir &quot;em&quot; (barra superior) limite e anotar o valor correspondente (à direita da barra). Apenas os eventos que ocorrem nas regiões negras serão contadas. </li><li> Clique em &#39;reset&#39;. </li><li> Analisar stacks (atalho: 2) </li><li> Selecionar apenas uma série nesta fase, ou seja, o arquivo &#39;primeiro&#39; e &#39;último arquivo &quot;deve ser o mesmo. </li><li> Digite os valores de &#39;limiar para subtraído &quot;,&quot; limite para a relação &quot;e&quot; limiar limite da célula. Deixe as outras configurações em seus valores padrão. </li><li> O algoritmo produz uma vidraça dupla em que a série processada é mostrado à esquerda eo original do lado direito. Cuidado passar por isso para avaliar o número de falsos positivos e as ocasiões em que os eventos, visível a olho nu, não foram detectados. Para obter uma maior precisão na detecção de transientes de Ca 2 +, pode ser necessário ajustar ligeiramente alguns dos &quot;parâmetros de partículas&quot;. Embora o processo pode parecer um pouco &#39;bater e perder &quot;na primeira tentativa, rapidamente fica uma sensação como a que parâmetros são fundamentais. </li><li> Para cada série, o algoritmo produz um arquivo de Excel que detalha características do evento detectado (como área de amplitude, e posição). &quot;Falsos positivos&quot; - identificado por revisar os arquivos de imagem que as saídas de algoritmo (por exemplo, passo 8.17) - pode ser afastado, à mão, a partir deste ficheiro Excel. </li></ol>

<ol>
	<li>Haugland, R. P., Gregory, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indicators+for+Ca2+,+Mg2+,+Zn2++and+other+metal+ions.">Indicators for Ca2+, Mg2+, Zn2+ and other metal ions.</a> Handbook of fluorescent probes and research products. , 771-826 (2002).</li><li>Boland, B., Himpens, B., Gillis, J. M., Casteels, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+force+and+Ca2++in+anococcygeal+and+vas+deferens+smooth+muscle+cells+of+the+mouse.">Relationship between force and Ca2+ in anococcygeal and vas deferens smooth muscle cells of the mouse.</a> Pflugers Arch. 421, 43-51 (1992).</li><li>Hashitani, H., Fukuta, H., Takano, H., Klemm, M. F., Suzuki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+propagation+of+spontaneous+excitation+in+smooth+muscle+of+the+guinea-pig+urinary+bladder.">Origin and propagation of spontaneous excitation in smooth muscle of the guinea-pig urinary bladder.</a> J Physiol. 150, 273-286 (2001).</li><li>Heppner, T. J., Bonev, A. D., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elementary+purinergic+Ca2++transients+evoked+by+nerve+stimulation+in+rat+urinary+bladder+smooth+muscle.">Elementary purinergic Ca2+ transients evoked by nerve stimulation in rat urinary bladder smooth muscle.</a> J. Physiol. 564, 201-212 (2005).</li><li>Brain, K. L., Jackson, V. M., Trout, S. J., Cunnane, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intermittent+ATP+release+from+nerve+terminals+elicits+focal+smooth+muscle+Ca2++transients+in+mouse+vas+deferens.">Intermittent ATP release from nerve terminals elicits focal smooth muscle Ca2+ transients in mouse vas deferens.</a> J. Physiol. 541, 849-862 (2002).</li><li>Fleichman, M., Schneider, T., Fetscher, C., Michel, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+transduction+underlying+carbachol-induced+contraction+of+rat+urinary+bladder+II.+Protein+kinases.">Signal transduction underlying carbachol-induced contraction of rat urinary bladder II. Protein kinases.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 308, 54-58 (2004).</li><li>Young, J. S., Meng, E., Cunnane, T. C., Brain, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+purinergic+neurotransmission+in+the+mouse+urinary+bladder.">Spontaneous purinergic neurotransmission in the mouse urinary bladder.</a> J. Physiol. 586, 5743-5755 (2008).</li><li>Nelson, M. T., Cheng, H., Rubart, M., Santana, L. F., Bonev, A. D., Knot, H. J., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relaxation+of+arterial+smooth+muscle+by+calcium+sparks.">Relaxation of arterial smooth muscle by calcium sparks.</a> Science. 270, 633-637 (1995).</li><li>Th&#233;venaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity.">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Trans. Image Process. 7, 27-41 (1998).</li></ol>

Foram feitos esforços para minimizar o número de animais utilizados eo seu sofrimento, todos os experimentos foram realizados de acordo com os Animais do Reino Unido (Scientific Procedures) Act 1986 e Comunidades Europeias Directiva do Conselho 86/09/EEC.

Escolha de fluorescentes Ca 2 + indicador Oregon Verde 488-BAPTA 01:00 foi escolhido como o Ca 2 + indicador porque (i) é brilhante em comparação com outros indicadores (por exemplo, Fluo-4 e Verde de cálcio) 1, (ii) é sensível a mudanças fisiológicas na concentração de Ca 2 + com um d K de magnitude similar 1 para o Ca 2 + intracelular concentração [Ca 2 +] i (por exemplo, de canais deferentes 2), (iii) carrega muitas células do músculo liso, permitindo que células do músculo liso de acoplamento a ser monitorado. No entanto, Oregon Verde 488-BAPTA 01:00 é um não-ratioable Ca 2 + indicador, e como tal não pode ser facilmente utilizado para determinar o absoluto [Ca 2 +] i. Além disso, pode também buffer de Ca 2 + se presente em altas concentrações e torna-se saturado com mudanças na amplitude de alta [Ca 2 +] i. Inibição da contratilidade espontânea A contratilidade espontânea de órgãos do músculo liso podem ser reduzidos farmacologicamente, como através do bloqueio da movimentação de Ca 2 + através de L-type Ca 2 + canais (por exemplo: nifedipina 3; diltiazem 4). Note-se que estas drogas irá reduzir muito a amplitude de toda célula Ca 2 + flashes / transientes. Contração dos vasos deferentes resulta de uma combinação de neurotransmissão principalmente purinérgicos e noradrenérgicos. Focal Ca 2 + transientes neste tecido são, no entanto, insensível ao bloqueio dos receptores noradrenérgicos (por exemplo, α adrenoceptor 1, por prazosin 5) para o movimento pode ser reduzida sem afetar focal Ca 2 + transientes. Alternativamente, a contração pode ser impedido &quot;a jusante&quot; através da inibição da miosina quinase de cadeia leve por exemplo, por wortmannin 6. Conclusões Monitoramento Ca 2 + fluorescência em submicron resolução é uma técnica poderosa para estudar os efeitos pós-juncional da liberação de neurotransmissores 5,7 e liberação de Ca 2 + das lojas internas (por exemplo, &quot;faíscas&quot; 8). A análise dos transientes de Ca 2 + utilizando a metodologia descrita aqui é custo-efetiva em comparação com comercialmente disponíveis pacotes de análise de imagem e permite tailor-made análise através de plugins personalizados escritos em Java para ImageJ.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Oregon Green 488 BAPTA-1 AM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>O6807</td>
<td>10 x 50 &mu;g</td>
</tr>
<tr>
<td>Pluronic F-127 solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>P3000MP</td>
<td>20% solution in DMSO</td>
</tr>
<tr>
<td>Leica SP2 upright confocal microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leica</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Air table (&#x2018;vibration isolated workstation&#x2019;)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Newport</td>
<td>M-VW-3046-OPT-012140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sylgard 184 elastomer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

focal ca2+ transient detection in smooth muscle

Ca 2 + imagens do músculo liso fornece insights sobre os mecanismos celulares que podem não resultar em mudanças de potencial de membrana, como a liberação de Ca 2 + das lojas internas, e permite que várias células para ser monitorados simultaneamente para avaliar, por exemplo, o acoplamento em tecido sincicial. Subcelulares Ca 2 + transientes são comuns no músculo liso, mas são difíceis de medir com precisão, devido aos problemas causados ​​pela sua ocorrência estocástica, sobre um campo de visão amplo, muitas vezes, em um órgão que propensos a contrair. Para ultrapassar este problema, temos desenvolvido uma série de protocolos de imagem e rotinas de análise de adquirir e, em seguida, analisar, de forma automatizada, a localização, freqüência e amplitude de tais eventos. Embora essa abordagem pode ser aplicada em outros contextos, o nosso próprio trabalho envolve a detecção de locais purinérgicos Ca 2 + transitórios para a localização de liberação do transmissor com resolução submicron. ATP é liberado como um cotransmitter de nervos autônomos, onde se liga a receptores P2X1 sobre o músculo liso do detrusor e canal deferente. Ca 2 + entra no músculo liso, resultando em purinérgicos Neuroefetora Ca 2 + transientes (NSTI). A focal Ca 2 + transientes permitam o monitoramento óptico da liberação de neurotransmissores de uma forma que tem muitas vantagens sobre eletrofisiologia. Além da resolução espacial muito melhorada, a gravação óptica tem a vantagem adicional de permitir a gravação da liberação do transmissor de muitos locais distintos simultaneamente. Além disso, o plano óptico de foco é mais fácil de manter ou corrigir durante a gravação longa série que é o reposicionamento de um microeletrodo intracelular afiada. Em resumo, um método para geração de imagens de Ca 2 + fluorescência é descrito que detalha a preparação do tecido, e na aquisição e análise de dados. Destacamos o uso de vários scripts para a análise de Ca 2 +, tais transientes.

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Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Detalhes métodos de alta resolução Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Imagem do músculo liso dentro órgãos isolados, incluindo: preparação do tecido de aquisição de imagem e análise de dados.

Focal Ca 2 + Detecção de transitórios no músculo liso

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ ...

focal-ca2-transient-detection-in-smooth-muscle

Research

JoVE Journal

Biology

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

11.2K visualizações.  University of Oxford. Detalhes métodos de alta resolução Ca 2 + Imagem do músculo liso dentro órgãos isolados, incluindo: preparação do tecido de aquisição de imagem e análise de dados.

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Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded and their collection does not imply any added risk to the newborn or mother s health. Moreover no ethical concerns are raised. The UC is composed by one vein and two arteries from which both endothelial cells (ECs) 1 and smooth muscle cells (SMCs) 2, two of the main cellular components of blood vessels, can be isolated. In this project the SMCs were obtained after enzymatic treatment of the UC arteries accordingly the experimental procedure previously described by Jaffe et al 3. After cell isolation they were kept in t-flash with DMEM-F12 supplemented with 5% of fetal bovine serum and were cultured for several passages. Cells maintained their morphological and other phenotypic characteristics in the different generations. The aim of this study was to isolate smooth muscle cells in order to use them as models for future assays with constrictor drugs, isolate and structurally characterize L-type calcium channels, to study cellular and molecular aspects of the vascular function 4 and to use them in tissue engineering.

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells HUASMC

The umbilical cords are used to isolate smooth muscle cells by different ways. In this work we used the enzymatic treatment to isolated smooth muscle cells.

Isolamento da Human Umbilical células musculares arteriais (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded ...

Biologia

Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography

Contraction or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries determines the artery diameter and thereby controls flow of blood through the vessel and contributes to systemic blood pressure. The contraction process is regulated primarily by cytosolic calcium concentration ([Ca2+]cyt), which is in turn controlled by a variety of ion transporters and channels. Ion channels are common intermediates in signal transduction pathways activated by vasoactive hormones to effect vasoconstriction or vasodilation. And ion channels are often targeted by therapeutic agents either intentionally (e.g. calcium channel blockers used to induce vasodilation and lower blood pressure) or unintentionally (e.g. to induce unwanted cardiovascular side effects).
Kv7 (KCNQ) voltage-activated potassium channels have recently been implicated as important physiological and therapeutic targets for regulation of smooth muscle contraction. To elucidate the specific roles of Kv7 channels in both physiological signal transduction and in the actions of therapeutic agents, we need to study how their activity is modulated at the cellular level as well as evaluate their contribution in the context of the intact artery.
The rat mesenteric arteries provide a useful model system. The arteries can be easily dissected, cleaned of connective tissue, and used to prepare isolated arterial myocytes for patch clamp electrophysiology, or cannulated and pressurized for measurements of vasoconstrictor/vasodilator responses under relatively physiological conditions. Here we describe the methods used for both types of measurements and provide some examples of how the experimental design can be integrated to provide a clearer understanding of the roles of these ion channels in the regulation of vascular tone.

Measurements of Kv7 (KCNQ) potassium channel activity in isolated arterial myocytes (using patch clamp electrophysiological techniques) in parallel with measurements of constrictor/dilator responses (using pressure myography) can reveal important information about the roles of Kv7 channels in vascular smooth muscle physiology and pharmacology.

Explorando Arterial Músculo Liso KV7 função dos canais de potássio utilizando electrofisiologia patch clamp e Miografia Pressão

Contraction  or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries  determines the artery diameter and thereby controls flow of ...

Isolation of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells from Neonatal Mice

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling pathways involved in vascular smooth muscle contraction in PASMC from fetal sheep. While sheep make an excellent model of term pulmonary hypertension, they are very expensive and lack the advantage of genetic manipulation found in mice. Conversely, the inability to isolate PASMC from mice was a significant limitation of that system. Here we described the isolation of primary cultures of mouse PASMC from P7, P14, and P21 mice using a variation of the previously described technique of Marshall et al.26 that was previously used to isolate rat PASMC. These murine PASMC represent a novel tool for the study of signaling pathways in the neonatal period. Briefly, a slurry of 0.5% (w/v) agarose + 0.5% iron particles in M199 media is infused into the pulmonary vascular bed via the right ventricle (RV). The iron particles are 0.2 &#956;M in diameter and cannot pass through the pulmonary capillary bed. Thus, the iron lodges in the small pulmonary arteries (PA). The lungs are inflated with agarose, removed and dissociated. The iron-containing vessels are pulled down with a magnet. After collagenase (80 U/ml) treatment and further dissociation, the vessels are put into a tissue culture dish in M199 media containing 20% fetal bovine serum (FBS), and antibiotics (M199 complete media) to allow cell migration onto the culture dish. This initial plate of cells is a 50-50 mixture of fibroblasts and PASMC. Thus, the pull down procedure is repeated multiple times to achieve a more pure PASMC population and remove any residual iron. Smooth muscle cell identity is confirmed by immunostaining for smooth muscle myosin and desmin.

We have developed a novel and reproducible technique to isolate primary cultures of pulmonary artery smooth muscle cells (PASMC) from mice as young as P7, thereby allowing better study of the signaling pathways involved in neonatal smooth muscle cell contraction and relaxation.

Isolamento de artéria pulmonar células musculares lisas de camundongos recém-nascidos

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling ...

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues. While this technique has been implemented for over 100 years, the versatility, simplicity and reproducibility of this assay helps it to remain an indispensable tool for pharmacologists and physiologists alike. Tissue bath systems are available in a wide array of shapes and sizes, allowing a scientist to evaluate samples as small as murine mesenteric arteries and as large as porcine ileum &#8211; if not larger. Central to the isolated tissue bath assay is the ability to measure concentration-dependent changes to isometric contraction, and how the efficacy and potency of contractile agonists can be manipulated by increasing concentrations of antagonists or inhibitors. Even though the general principles remain relatively similar, recent technological advances allow even more versatility to the tissue bath assay by incorporating computer-based data recording and analysis software. This video will demonstrate the function of the isolated tissue bath to measure the isometric contraction of an isolated smooth muscle (in this case rat thoracic aorta rings), and share the types of knowledge that can be created with this technique. Included are detailed descriptions of aortic tissue dissection and preparation, placement of aortic rings in the tissue bath and proper tissue equilibration prior to experimentation, tests of tissue viability, experimental design and implementation, and data quantitation. Aorta will be connected to isometric force transducers, the data from which will be captured using a commercially available analog-to-digital converter and bridge amplifier specifically designed for use in these experiments. The accompanying software to this system will be used to visualize the experiment and analyze captured data.

This protocol describes the measurement of isometric contraction in an isolated smooth muscle preparation, using an isolated tissue bath system and computer-based data acquisition.

A medição da função do músculo liso nas Isolado tecido de banho-aplicativos para Farmacologia Research

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on changes in intracellular calcium ([Ca2+]i) and nitric oxide (NO). In order to understand how [Ca2+]i, NO and downstream molecules are handled by a blood vessel in response to vasoconstrictors and vasodilators, we developed a novel technique that applies calcium-labeling (or NO-labeling) dyes with two photon microscopy to measure calcium handling (or NO production) in isolated blood vessels. Described here is a detailed step-by-step procedure that demonstrates how to isolate an aorta from a rat, label calcium or NO within the endothelial or smooth muscle cells, and image calcium transients (or NO production) using a two photon microscope following physiological or pharmacological stimuli. The benefits of using the method are multi-fold: 1) it is possible to simultaneously measure calcium transients in both endothelial cells and smooth muscle cells in response to different stimuli; 2) it allows one to image endothelial cells and smooth muscle cells in their native setting; 3) this method is very sensitive to intracellular calcium or NO changes and generates high resolution images for precise measurements; and 4) described approach can be applied to the measurement of other molecules, such as reactive oxygen species. In summary, application of two photon laser emission microscopy to monitor calcium transients and NO production in the endothelial and smooth muscle cells of an isolated blood vessel has provided high quality quantitative data and promoted our understanding of the mechanisms regulating vascular function.

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Vascular cell functiondepends on activity of intracellular messengers. Described here is an ex vivo two photon imaging method that allows the measurement of intracellular calcium and nitric oxide levels in response to physiological and pharmacological stimuli in individual endothelial and smooth muscle cells of an isolated aorta.

Dois fótons de imagem de cálcio intracelular<sup&gt; 2+</sup&gt; Manuseio e produção de óxido nítrico no endotélio e músculo liso células de uma aorta de rato isolada

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

Measurement of Calcium Fluctuations Within the Sarcoplasmic Reticulum of Cultured Smooth Muscle Cells Using FRET-based Confocal Imaging

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall health. A significant portion of intracellular Ca2+ content is found within the SR stores in VSMCs. As the only intracellular organelle with a close association to the surrounding extracellular space through plasma membrane-SR junctions, the SR can be considered to constitute the first line of response to any irregularity in Ca2+ transients, or stress experienced by the cell. Among its many functions, one of the most important is its role in the transmission of Ca2+-regulated signals throughout the cell to induce further cell-wide reactions downstream. The more common use of cytoplasmic Ca2+ indicators in this regard is overall insufficient for research into the highly dynamic changes to the intraluminal SR Ca2+ store that have yet to be fully characterized. Here, we provide a detailed protocol for the direct and clear measurement of luminal SR Ca2+. This tool is useful for investigation into the nuanced changes in SR Ca2+ that have significant subsequent effects on the normal function and health of the cell. Fluctuations in SR Ca2+ content specifically can provide us with a significant amount of information pertaining to cellular responses to disease or stress conditions experienced by the cell. In this method, a modified version of a SR-targeted Ca2+ indicator, D1SR, is used to detect Ca2+ fluctuations in response to the introduction of agents to cultured rat aortic smooth muscle cells (SMCs). Following incubation with the D1SR indicator, confocal fluorescence microscopy and fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based imaging are used to directly observe changes to intraluminal SR Ca2+ levels under control conditions and with the addition of agonist agents that function to induce intracellular Ca2+ movement.

Currently, most available calcium indicators are used to quantify cytoplasmic calcium transients as indirect measures of calcium released from the sarcoplasmic reticulum in cultured smooth muscle cells. This protocol describes the use of a specific FRET-based indicator that allows direct measurement of calcium signals within the sarcoplasmic reticulum lumen.

Medição das flutuações cálcio dentro do Sarcoplasmic retículo de células musculares lisas cultivadas utilizando FRET baseado em imagem confocal

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs from the coronary circulation. Hearts with intact aortic arches were removed and perfused via retrograde Langendorff with digestion solution containing 300 Units/ml of collagenase type II, 0.1 mg/ml soybean trypsin inhibitor and 1 M CaCl2. The perfusates were collected at 15 min intervals for 90 min, pelleted by centrifugation, resuspended in plating media, and plated on tissue culture dishes. VSMCs were characterized by presence of SM22&#945;, &#945;-SMA, and vimentin. One of the main advantages of using this technique is the ability to isolate VSMCs from the coronary circulation of mice. Although the small number of cells obtained can limit some of the applications for which the cells can be utilized, isolated coronary VSMCs can be used in a variety of well-established cell culture techniques and assays. Studies investigating VSMCs from genetically modified mice can provide further information about structure-function and signaling processes associated with vascular pathologies.

The purpose of this protocol is to demonstrate the isolation and culture techniques of murine primary vascular smooth muscle cells (VSMCs) from the coronary circulation. Once VSMCs have been isolated, they can be used for many standard culture techniques.

Isolamento de Murino vasculares coronários células musculares lisas

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Murine Aortic Crush Injury: An Efficient In Vivo Model of Smooth Muscle Cell Proliferation and Endothelial Function

Arterial reconstruction, whether angioplasty or bypass surgery, involves iatrogenic trauma causing endothelial disruption and vascular smooth muscle cell (VSMC) proliferation. Common murine models study small vessels such as the carotid and femoral arteries. Herein we describe an in vivo system in which both VSMC proliferation and endothelial barrier function can be simultaneously assessed in a large vessel. We studied the infrarenal aortic response to injury in C57BL/6 mice. The aorta was injured from the left renal vein to the aortic bifurcation by 30 transmural crushes of 5-seconds duration with a cotton-tipped applicator. Morphological changes were assessed with conventional histology. Aorta wall thickness was measured from the luminal surface to the adventitia. EdU integration and counter staining with DAPI and alpha-actin was used to demonstrate VSMC proliferation. Activation of ERK1/2, a known moderator of intimal hyperplasia formation, was determined by Western Blot analysis. The effect of inflammation was determined by immunohistochemistry for B-cells, T-cells, and macrophages. En face sections of endothelium were visualized with scanning electron microscopy (SEM). Endothelial barrier function was determined with Evans Blue staining. Transmural injury resulted in aortic wall thickening. This injury induced VSMC proliferation, most prominently at 3 days after injury, and early activation of ERK1/2 and decreased p27kip1 expression. Injury did not result in increased B-cells, T-cells, or macrophages infiltration in the vessel wall. Injury caused partial endothelial cell denudation and loss of cell-cell contact. Injury resulted in a significant loss of endothelial barrier function, which returned to baseline after seven days. The murine transmural blunt aortic injury model provides an efficient system to simultaneously study both VSMC proliferation and endothelial barrier function in a large vessel.

Murine Aortic Crush Injury: An Efficient In Vivo Model of Smooth Muscle Cell Proliferation and Endothelial Function

Restenosis following cardiovascular procedures (bypass surgery, angioplasty, or stenting) is a significant problem reducing the durability of these procedures. An ideal therapy would inhibit smooth muscle cell (VSMC) proliferation while promoting regeneration of the endothelium. We describe a model for simultaneous assessment of VSMC proliferation and endothelial function in vivo.

Lesão por esmagamento aórtico murino: um eficiente<em&gt; In Vivo</em&gt; Modelo de proliferação de células musculares lisas e função endotelial

Arterial reconstruction, whether angioplasty or bypass surgery, involves iatrogenic trauma causing endothelial disruption and vascular smooth muscle cell ...

Measuring Proliferation of Vascular Smooth Muscle Cells Using Click Chemistry

The ability of a cell to proliferate is integral to the normal function of most cells, and dysregulation of proliferation is at the heart of many disease processes. For these reasons, measuring proliferation is a common tool used to assess cell function. Cell proliferation can be measured simply by counting; however, this is an indirect means of measuring proliferation. One common means of directly detecting cells preparing to divide is by incorporation of labeled nucleoside analogs. These include the radioactive nucleoside analog 3H-thymidine plus non-radioactive nucleoside analogs such as 5-bromo-2&#8217; deoxyuridine (BrdU) and 5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EdU). Incorporation of EdU is detected by click chemistry, which has several advantages when compared to BrdU. In this report, we provide a protocol for measuring proliferation by the incorporation of EdU. This protocol includes options for various readouts, along with the advantages and disadvantages of each. We also discuss places where the protocol can be optimized or altered to meet the specific needs of the experiment planned. Finally, we touch on the ways that this basic protocol can be modified for measuring other cell metabolites.

Proliferation is a critical part of cellular function, and a common readout used to assess potential toxicity of new drugs. Measuring proliferation is, therefore, a frequently used assay in cell biology. Here we present a simple, versatile method of measuring proliferation that can be used in adherent and non-adherent cells.

Medição da proliferação de células musculares vasculares lisas usando química clique

The ability of a cell to proliferate is integral to the normal function of most cells, and dysregulation of proliferation is at the heart of many disease ...

Isolation of Primary Patient-specific Aortic Smooth Muscle Cells and Semiquantitative Real-time Contraction Measurements In Vitro

Smooth muscle cells (SMCs) are the predominant cell type in the aortic media. Their contractile machinery is important for the transmission of force in the aorta and regulates vasoconstriction and vasodilation. Mutations in genes encoding for the SMC contractile apparatus proteins are associated with aortic diseases, such as thoracic aortic aneurysms. Measuring SMC contraction in vitro is challenging, especially in a high-throughput manner, which is essential for screening patient material. Currently available methods are not suitable for this purpose. This paper presents a novel method based on electric cell-substrate impedance sensing (ECIS). First, an explant protocol is described to isolate patient-specific human primary SMCs from aortic biopsies and patient-specific human primary dermal fibroblasts for the study of aortic aneurysms. Next, a detailed description of a new contraction method is given to measure the contractile response of these cells, including the subsequent analysis and suggestion for comparing different groups. This method can be used to study the contraction of adherent cells in the context of translational (cardiovascular) studies and patient and drug screening studies.

Isolation of Primary Patient-specific Aortic Smooth Muscle Cells and Semiquantitative Real-time Contraction Measurements In Vitro

This paper describes an explant culture-based method for the isolation and culturing of primary, patient-specific human aortic smooth muscle cells and dermal fibroblasts. Furthermore, a novel method is presented for measuring cell contraction and subsequent analysis, which can be used to study patient-specific differences in these cells.

Isolamento de células musculares lisas aórticas específicas do paciente primário e medidas de contração em tempo real semiquantitativas in vitro

Smooth muscle cells (SMCs) are the predominant cell type in the aortic media. Their contractile machinery is important for the transmission of force in ...