O objetivo deste procedimento é ter um modelo ex vivo para avaliar a remodelagem óssea e recriar o microambiente tumor-ósseo utilizando cultura calvária ou co-cultura com células cancerosas. A maior parte da técnica de calvária é um sistema de cultura de órgãos que utiliza ossos de calvaria de camundongos neonatais para avaliar a remodelagem óssea. Você pode testar o potencial terapêutico de moléculas diversas, ou até mesmo recriar o microambiente tumoral ósseo quando você usa co-culturas com células cancerosas.
Tudo isso em um ensaio simples e fácil em pouco tempo e baixo custo. O objetivo desta técnica é ter uma ferramenta para avaliar a regeneração óssea no microambiente ósseo do câncer, utilizando um modelo ex vivo de cultura de órgãos calvariais de camundongos. Primeiro, selecione um filhote de rato e coloque-o sob o capô.
Usamos calvaria de filhotes de rato de cinco a sete dias. Pegue a cabeça com a seringa, corte a pele e limpe a área do couro cabeludo o suficiente para dissecar a calvaria. Identifique as suturas do crânio, sagital, coronal e lambdoides.
Faça um corte reto ao longo das suturas lambdoid, para cerca do nível do olho. Corte de cada lado, das suturas lambdoid em direção à sutura coronal. No ângulo de 45, faça outro corte para conectar a extremidade do corte feito com o corte do fontanel anterior.
É extremamente importante definir as suturas do crânio, sagital, frontal, coronal, lambdoide, para garantir a inclusão correta do tecido e análise histologia. Com boas pontas fórceps, retire a calvaria e coloque-a em uma tampa de placa de Petri. Com um bisturi, faça um corte reto do fontanel posterior ao longo da sutura sagital através da sutura coronal.
Duas hemicalvarias são obtidas. Pegue cada calvaria com os fórceps, e coloque-os em uma nova placa de Petri com PBS. Para a cultura, coloque a hemicalvaria em uma placa de cultura tecidual de 24 poços, contendo um mililitro de mídia, e incubar por 24 horas a 37 graus.
Também podemos usar culturas primárias de calvária para reproduzir o microambiente tumor-ósseo para resorção óssea. Para isso, co-cultura calvarias com células cancerosas, ou com mídia condicionada de células cancerosas. 24 horas depois, remova a mídia e substitua-a por mídia contendo o tratamento que você gostaria de testar.
Se você deseja avaliar as células cancerígenas e as interações ósseas, ou recriar o microambiente tumor-ósseo, passe a calvaria para uma placa de apego celular baixa, para evitar a fixação das células cancerosas à placa. Tentepsinizar as células cancerígenas, contá-las, e colocá-las cuidadosamente no topo da hemicalvaria. Você também pode usar mídia condicional de células cancerosas, e usá-la para incubar a hemicalvaria.
Incubar por seis a sete dias a 37 graus, com 5% de CO2. No terceiro dia, mude a mídia e continue incubando. O número de células que usam na cocultura depende da linha celular do câncer.
Você precisa, primeiro, otimizar o número de células que é necessário para induzir uma resposta em uma. Após a cultura, a calvária passa por um processo de fixação, descalcificação e parafina incorporada. Além disso, os tecidos são seccionados em um microtome, manchados, e a análise histomorfométrica é realizada.
A inclusão da calvaria pode ser complicada. Para garantir que o tecido esteja protegido durante a inclusão, você pode colocar o tecido entre esponjas ou usar um papel de tecido ou outro papel absorvente antes de colocá-lo no. Para o processamento de tecidos, enrole a hemicalvaria em papel de tecido.
Em seguida, coloque-o em um de incorporação, e fixe em tampão neutro em formalina, por 24 horas a quatro graus. Para decalcificar a calvaria, coloque o em um EDTA de 10% por 48 horas a quatro graus. Processe as fitas de tecido com a hemicalvaria em um processador automático de tecido.
Siga um ciclo regular de rotação do dia, então, inclua em parafina. Para secção, corte quatro seções micromáticas com um microtome, monte as seções em lâminas de microscópio de vidro e manche com hematoxilina, eosina. A análise histologia foi utilizada para a realização de análise quantitativa da superfície óssea e das áreas de remodelação óssea.
As imagens da calvária nos sete dias foram analisadas utilizando-se o software de imagem. Para avaliação quantitativa, primeiro, defina a área para a análise. Procure nas seções no telopa onde quatro X para identificar a orientação e as suturas.
Defina a sutura coronal e identifique a superfície óssea longa de um lado e, em seguida, a superfície curta do outro. Sob a ampliação de 40X, identifique a sutura coronal e mova dois ou três campos ópticos para longe da sutura, ao longo da superfície longa. Capture a imagem desta área para análise.
Você pode usar o software de imagens para analisar a integridade estrutural do osso. Pode ser feita análise histomorfométrica quantitativa para a espessura e a área óssea da hemicalvaria. A análise correta da calvária depende de uma boa incorporação e orientação adequada para resultados histológicos consistentes.
Certifique-se de usar pelo menos três calvaria por condição experimental. Aqui, podemos ver a estrutura do osso. Em laranja, o osso é observado.
Também podemos ver a presença do periósteo, ostocito, endosteum e outras partes do osso. No nosso caso, usamos insulina para aumentar a remodelagem óssea. Comparado com um controle, podemos ver um aumento significativo na área óssea.
Aqui, podemos ver o efeito da linha celular MDA-MB-231 no modelo calvaria. Podemos ver, em comparação com o controle, que a presença de células cancerígenas induz fatores osteolíticos que estimulam a destruição óssea. Utilizamos o modelo calvaria para medir a regeneração óssea e as interações células-ósseas cancerígenas por co-culturas com células cancerosas e histologia.
Também validamos nossos dados por PCR quantitativo em tempo real. Este modelo ex vivo tem muitas vantagens, como a organização tridimensional e a diversidade celular do osso são preservadas, e as condições experimentais podem ser controladas. Além disso, o modelo é simples, você pode ver resultados em um curto período de tempo, e é de baixo custo.
E pode ser combinado com outras técnicas, como PCR quantitativo em tempo real, microscopia e micro-CT.
