O coração contém população heterogênea de células imunes que desempenham papéis cruciais na inflamação cardíaca, bem como na reparação. Para entender a heterogeneidade das células imunes e obter mais informações sobre sua função, é importante ter um método que permita a recuperação dessas células do coração. Essa técnica pode ajudar a descobrir a diversidade de células imunes e não imunes que reside no coração saudável ou doente.
Há três principais vantagens nessa técnica. Primeiro, é um simples fluxo de trabalho único que leva à geração de suspensão de célula única de vários tipos de células dentro de três horas de tempo. Em segundo lugar, leva à alta recuperação de populações de células imunes viáveis e não imunes.
E terceiro, é um método muito versátil e pode ser aplicado a tecidos cardíacos em outras espécies também. Prestar atenção à quantidade de tecido usada para uma única reação de digestão é importante. Use tesoura estéril, disseque amostras de tecido da parede apical ou lateral do ventrículo esquerdo em soro fisiológico frio ou HBSS.
Disseca cuidadosamente a gordura epicárardial e o chordae tendineae do espécime. Com a ajuda de uma lâmina ou tesoura estéril, disseque os pedaços de tecido em pedaços pesando aproximadamente 200 miligramas. Depois de eutanásia do rato, abra a cavidade torácica com a ajuda de uma tesoura afiada.
Use hemostatas contundentes para levantar o coração para cima. Perfunda o coração com PBS frio usando uma agulha de calibre 25 presa a uma seringa de cinco mililitros. Perfuse até que o coração apareça branqueado em cores.
Retire o coração e coloque-o em uma placa de Petri estéril no gelo. Coloque 200 miligramas de pedaços de tecido cardíaco humano ou coração murino em uma placa de Petri estéril. Pique bem o tecido usando uma lâmina ou uma tesoura estéreis.
Para configurar digestões, em um tubo cônico de 15 mililitros, prepare um volume final de digestão de três mililitros para cada pedaço de tecido cardíaco humano ou um coração murino com enzimas colagenase I, DNase I e hialuronidase em concentrações de 450, 60 e 60 unidades por mililitro. Adicione 2,5 mililitros de DMEM no tubo. Com a ajuda de fórceps limpos, coloque o tecido finamente picado em cada tubo de reação.
Misture bem com vórtice suave. Digerir por uma hora a 37 graus Celsius em uma incubadora de agitação definida a uma velocidade de agitação baixa a média. Após uma hora de digestão, retire os tubos da incubadora e coloque no gelo.
Configure tubos cônicos de 50 mililitros com um coador de células de 40 mícrons em cima. Molhe os filtros com dois mililitros de enzima desativando o tampão. Em seguida, desative as enzimas de digestão adicionando oito mililitros de enzimas desativando tampão a cada tubo de digestão.
Em seguida, despeje os 13 mililitros resultantes da mistura total através do coador de células de 40 mícrons nos tubos cônicos de 50 mililitros. Transfira as amostras filtradas de volta em tubos cônicos frescos de 15 mililitros. Gire as amostras a 400 vezes g por seis minutos a quatro graus Celsius.
Descarte o supernatante deixando 0,5 mililitros de mídia. Resuspenque a pelota celular por pipetação suave e adicione um mililitro de tampão de lise ACK. Gire suavemente o tubo e incubar à temperatura ambiente por cinco minutos para realizar a lise dos glóbulos vermelhos.
Após cinco minutos no buffer ACK, adicione nove mililitros de DMEM à amostra. Coloque a tampa de volta nos tubos e inverta suavemente os tubos para misturar. Filtre através de um coador de células de 40 mícrons e colete o filtrado em tubos cônicos de 15 mililitros.
Centrifugar os tubos a 400 vezes g por seis minutos e descartar o supernatante. Adicione um mililitro de tampão FACS e resuspense a pelota. Em seguida, transfira para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.
Centrifugar novamente a 400 vezes g por cinco minutos. Descarte o supernatante e resuspenque a pelota em 100 microliters de tampão FACS. Uma única suspensão celular está pronta para coloração de anticorpos.
Adicione um painel típico de anticorpos humanos às amostras do coração em uma a 50 diluições. Use diferentes anticorpos para células estromicas e macrófagos cardíacos murinos. Incubar por 30 a 40 minutos a quatro graus Celsius no escuro.
Adicione um mililitro de tampão FACS, vórtice suavemente e centrífuga a 400 vezes g por cinco minutos. Repita este passo de lavagem uma segunda vez. Em seguida, resuspenja a amostra em 350 microliters de tampão FACS e adicione DAPI para alcançar uma concentração final de um micromolar.
As amostras estão prontas para análise facs. Neste protocolo, foi alcançado o isolamento dos macrófagos do rato e do miocárdio humano. Esta figura mostra núcleo LVAD humano não processado e processado.
Foram apresentados o esquema de gating para a triagem de fluxo de macrófagos humanos negativos ccr2 e CCR2 do miocárdio humano, bem como para células estrômicas negativas CD45 da cardiomiopatia isquêmica humana. As imagens de Wright manchado FACS classificados CD45 positivo e CÉLULAS CD45 negativas mostram membrana celular intacta indicando viabilidade. O esquema de gating para classificar macrófagos de um coração de rato também foi bem sucedido.
O peso do tecido usado para reação enzimática é fundamental para uma digestão eficiente. Use não mais do que 200 miligramas de tecido para as concentrações enzimáticas indicadas no protocolo. Seguindo este método, as células podem ser cultivadas para ensaios de estimulação in vitro.
As células podem ser classificadas para sequenciamento de RNA em massa ou sequenciamento de células únicas. Este método tem servido como uma técnica inestimável na descoberta da heterogeneidade macrófago não reconhecida anteriormente não reconhecida que está presente no coração humano saudável ou doente. Usando este método seguido de sequenciamento de células únicas, estudos estão em andamento para descobrir como várias células imunes e não imunes variam de coração doente versus coração saudável.
