Primaquine é uma conhecida droga antimalária. A determinação da primaquina em fluidos biológicos é frequentemente necessária para avaliar a farmacocinética. Atualmente, as principais técnicas para a determinação primaquine são baseadas no HPLC.
Os procedimentos do HPLC podem ser bastante complicados e demorados. Portanto, este método oferece uma maneira simples de detecção rápida de Primaquine. Este método Griess é potencialmente a maneira mais simples e econômica para a quantificação primaquine.
Além disso, este método pode oferecer possibilidades de detecção de Primaquine a olho nu sem a necessidade de qualquer equipamento. Além de amostras de soro e urina, este método também poderia ser usado para determinar quantitativamente primaquina em formulações farmacêuticas, por exemplo, a determinação de Primaquine em comprimidos para o controle de qualidade de fabricação. Demonstrando o procedimento estarão a Srta. Wu Yalan e Wu Shengjun, duas alunas de pós-graduação do meu laboratório.
Comece dissolvendo 0,1 mililitros de anilina e bifosfato primaquine em 10 mililitros de solução de ácido fosfórico de 5% em um frasco de fundo marrom de 25 mililitros. Coloque o frasco em um banho de gelo, e adicione uma barra de agitação. Em seguida, coloque o banho de gelo em um prato de agitação.
Dissolva 6,9 miligramas de nitrato de sódio e um mililitro de água resfriada e adicione-o ao frasco em termos de gota. Retire o banho de gelo e mantenha a mistura de reação mexendo à temperatura ambiente. Monitore a reação com uma cromatografia de camada fina revestida de gel de sílica ou placa TLC, usando uma mistura de metanol de diclorometano como eluente.
O produto azo exibe manchas coloridas na placa TLC. Pare a reação quando as manchas do PMQ desaparecerem. Ajuste o pH da mistura de reação para maior que 10 adicionando solução de hidróxido de sódio a um banho de gelo.
Em seguida, use um funil de separação de 50 mililitros para extrair a mistura três vezes com 20 mililitros de acetato etílico por extração. Quando terminar, misture e concentre a fase orgânica sob vácuo usando um evaporador rotativo. Purifique os resíduos usando cromatografia flash com gel de sílica de fase inversa sob pressão normal.
Em seguida, seque a solução por liofilização para obter o produto azo desejado. Para medir o espectro de absorção UV vis, dissolva o azo puro em água destilada ou ácido fosfórico de 5%, e use o espectrofotômetro para registrar o espectrômetro de absorção à temperatura ambiente. Para medir a absorção do PMQ, comece dissolvendo 4-metoxianilina em cloreto de hidrogênio molar 0,2 para uma solução de anilina de 200 milimolar.
Em seguida, dissolva o nitrito de sódio em água destilada para obter uma solução de cinco mililitros. Mantenha as soluções a quatro graus Celsius. Adicione 100 microliters da solução anilina a uma placa de 96 poços.
Em seguida, adicione 50 microliters da amostra contendo PMQ e misture-a com a anilina. Adicione 50 microliters da solução de nitrito de sódio à placa e misture o conteúdo por pipetação. Mantenha a placa em temperatura ambiente por 15 minutos e, em seguida, meça a absorção da solução em 504 nanômetros.
Exporte os dados como um arquivo de planilha para análise posterior. Para construir uma curva de calibração para medições de PMQ em amostras de urina, prepare soluções de PMQ em urina sintética em concentrações de zero, um, dois, cinco, 10, 20, 50, 100 e 200 micromolar. Prepare a reação de detecção do PMQ e meça a absorvência como descrito anteriormente.
Em seguida, gere uma curva de calibração baseada na absorção de 504 nanômetros e nas concentrações do PMQ. Subtrair os valores de absorção das amostras sem PMQ das medições de teste, e realizar um ajuste linear para gerar uma equação linear y é igual a x mais b, onde y é a absorção e tensão, e x é a concentração de PMQ. Para construir uma curva de calibração para medição de PMQ em amostras de soro humano, prepare soluções de PMQ em soro humano com concentrações de PMQ de zero, um, dois, cinco, 10, 20, 50, 100 e 200 micromolar.
Prepare a reação do PMQ. Meça a absorvência e construa a curva de calibração como descrito anteriormente. Adicione seis mililitros de sete a um hexano de acetato etílico em dois mililitros de soro contendo PMQ em um tubo de centrífuga de 15 mililitros.
Adicione 100 microlitres de duas soluções de hidróxido de sódio molar ao sistema de extração, e vórtice do tubo por 30 segundos. Em seguida, colete a camada orgânica e concentre-a com um evaporador rotativo sob vácuo. Dissolva o resíduo em 200 microliters de água destilada, e filtre através de uma membrana em forma de disco de 220 nanômetros do tamanho de um poro para remover componentes lipídicos insolúveis.
Construa a curva de calibração para PMQ em água destilada, em seguida, prepare uma reação de detecção com a solução extraída em uma placa de 96 poços como descrito anteriormente, e meça a absorvência. Em seguida, determine a concentração do PMQ de acordo com a equação linear da curva de calibração. As condições de reação foram otimizadas usando várias anilinas para associar com o PMQ através da reação de Griess.
Foram realizados cálculos teóricos e os resultados foram bons em acordo com as medições ópticas. Foi determinado que a 4-metoxianilina foi ideal para a reação de detecção do PMQ, devido ao seu bom desempenho e taxa de reação, solubilidade do produto e estabilidade. Além disso, o produto azo para 4-metoxianilina é de cor vermelha, que é fácil de distinguir com olhos nus.
Foram testados os efeitos do pH na absorção uv do produto azo e das soluções pmq. Enquanto o aumento do pH de 1,0 para 7,0 não muda a absorção, o pH básico tem um efeito significativo. Curvas de calibração foram construídas para a detecção de PMQ em amostras de urina e soro.
Uma relação linear foi encontrada quando o PMQ varia de zero a 200 micromolar na urina, e de 10 a 200 micromolars em soro. Para simular um soro real contendo PMQ, o PMQ foi adicionado ao soro humano em 0, 0,2, 0,5, 1.0, 2.0 micromolar concentrações. Por meio desse protocolo, as concentrações recuperadas foram 0,02, 0,14, 0,44, 0,90 e 1,78 micromolar, resultando em 90% de recuperação para concentrações acima de 0,5 micromolar.
Deve-se notar que o tempo para a reação atingir sua intensidade saturada é dependente da temperatura. Normalmente, 10 a 20 minutos é suficiente para temperatura entre 20 e 30 graus centígrados. No entanto, para concluir nosso exemplo de química griess para detecção de primaquine.
Design semelhante também é adequado para outras moléculas relevantes que têm reatividade química semelhante à primaquina.
