Este protocolo permite a entrega direta de terapêuticas no sistema nervoso central do rato para avaliar a farmacocinética, a farmacodinâmica e a eficácia de novas terapêuticas em modelos de doenças de ratos. Este procedimento é seguro, eficaz e não requer equipamentos caros ou ferramentas cirúrgicas. Demonstrando o procedimento estarão Yi Chen e Yi Luo, cientistas de pesquisa do meu laboratório.
Para preparar as cânulas guias especiais, use uma ferramenta rotativa com uma roda cortada para cortar ambas as extremidades de uma agulha de calibre 19 para obter uma cânula guia de aproximadamente um ano e meio a dois centímetros de comprimento. Em seguida, use a roda de moagem da ferramenta rotativa para suavizar ambas as extremidades. Para preparar o conjunto do fio do cateter, corte uma peça de oito centímetros de comprimento de tubo PE10 de diâmetro de 011 polegadas para servir como cateter intratecal para cada animal.
Use uma caneta marcadora resistente ao etanol para fazer uma marca de dois centímetros de uma extremidade de cada pedaço de tubo. Para cada animal, insira um fio de estilo de 11 centímetros de comprimento cortado do fio de aço inoxidável revestido de politetrafluoroetileno no lúmen do cateter PE10 de oito centímetros. Para preparar o conjunto do cateter de entrega, corte um pedaço de cateter PE50 de 5 a 10 centímetros de diâmetro e insira um adaptador de tubulação calibre 23 em uma extremidade do cateter.
Em seguida, insira uma agulha de calibre 30 com um hub cortado em um pedaço de aproximadamente 0,5 centímetros de tubulação PE10 e conecte a tubulação PE10 à outra extremidade do cateter. Para preparar um conjunto de agulhas-cânulas guia, coloque uma cânula guia sobre a extremidade de uma agulha de calibre 23. Antes de começar a cirurgia, coloque uma almofada de aquecimento na mesa de cirurgia e cubra a almofada com uma folha de cortina estéril.
Coloque um tubo de centrífuga cônica de 50mL sobre a folha e confirme a falta de resposta ao aperto do dedo do dedo do dedo no rato experimental anestesiado. Depois de pesar o animal, raspe as costas da cauda até a coluna torácica caudal e coloque o rato raspado na folha estéril na posição propensa. Posicione o tubo de 50mL sob o abdômen para flexionar a coluna vertebral na região lombar e aplique pomada oftalmica nos olhos.
Em seguida, injete subcutâneamente um miligrama por quilograma de liberação sustentada Buprenorphine e limpe a pele exposta com povidone sequencial e esfoliantes de álcool. Drape o animal com uma folha transparente estéril fenestrada. Para colocação do cateter e injeção do composto, identifique os dois poços naturais entre os músculos acima da pelve raspada, e com uma mão segurando os poços, use a outra mão para pressionar suavemente e sentir a coluna vertebral da direção caudal para rostral para localizar a primeira grande recuo entre as vértebras.
Depois de identificar o espaço intervertebral entre as vértebras S1 e L6, mova-se ligeiramente rostrally para identificar o espaço intervertebral entre as vértebras L5 e L6. Use um bisturi para fazer uma incisão de no máximo dois centímetros de comprimento na pele e cápsula muscular neste local ao longo da linha média do rostral à direção caudal para que o local da injeção esteja no centro da incisão. Use uma tesoura de dissecção para dissecar o tecido conjuntivo até que a camada muscular possa ser visualizada.
Faça uma incisão de um centímetro na cápsula muscular imediatamente lateral ao processo espinhal dorsal da vértebra lombar L6. Posicione o conjunto da agulha da cânula guia perto do aspecto anterior da sexta vértebra lombar e empurre o conjunto para o espaço intervertebral ao longo do aspecto anterior da sexta vértebra para que a extremidade da agulha penetre o canal espinhal. Use fórceps contundentes para localizar o processo espinhal dorsal da vértebra lombar L6 e empurre a agulha ao longo do aspecto anterior da sexta vértebra para o espaço invertebrata.
Empurre a cânula guia no lugar ao longo da agulha, remova a agulha e insira o conjunto do fio do cateter na cânula guia. Angling do cateter em um ângulo de aproximadamente 45 graus para o canal espinhal, forçar a extremidade do cateter aproximadamente 0,3 centímetros no canal. Remova o fio de esfogem aproximadamente 2,5 centímetros da ponta intratecal do cateter e avance o cateter para dentro do canal espinhal até que a marcação de dois centímetros no cateter seja visível abaixo do músculo.
Quando o cateter estiver no lugar, remova a cânula guia para deixar o cateter e o fio de estomado no lugar. Avance o cateter para dentro do canal espinhal até que a marca de dois centímetros esteja na entrada do canal e retire completamente o fio de estom. O fluido espinhal cerebral pode ser visualizado entrando no cateter implantado.
Em seguida, conecte o conjunto do cateter de entrega à extremidade distal do cateter implantado através da extremidade da agulha de calibre 30. Em seguida, carregue 60 microliters de soro fisiológico estéril em uma seringa de 100 microliteres e carregue um bolus de 30 microliters do composto de teste em uma segunda seringa. Conecte a seringa salina à extremidade adaptador de tubulação do conjunto do cateter de entrega e lave 20 microliters de soro fisiológico estéril no espaço intratecal.
Quando toda a solução salina tiver sido lavada, substitua a seringa salina pela seringa carregada de bolus e injete 30 microliters do composto de teste no espaço intratecal durante um período de 30 segundos. Quando todo o bolus tiver sido entregue, substitua a seringa carregada de bolus por outra seringa carregada salina e lave o cateter com mais 40 microlitadores de soro fisiológico. Quando o segundo volume de soro fisiológico tiver sido entregue, retire o conjunto do cateter de entrega do cateter implantado e use um par de fórceps de dissecção esterilizados pelo calor muito quente para fixar na tubulação para cortar asepticamente e selar o cateter implantado.
Use suturas de monofilamento absorvíveis para fixar o cateter selado a calor no tecido conjuntivo e, em seguida, use suturas nãoabsorbáveis para fechar a pele. Em seguida, use gaze e soro fisiológico para lavar qualquer sangue da pele e coloque o rato em uma incubadora aquecida com monitoramento até a recomposição total. Neste experimento representativo, foi obtido um knockdown muito bom em todas as regiões coletadas após a entrega de oligonucleotídeos de bolonucleotídeo único, como demonstrado.
No entanto, algum grau de variabilidade regional foi medido com a medula espinhal apresentando o maior percentual de knockdown. Após uma injeção bem sucedida do oligonucleotídeo antissamo- americano, ou outras terapêuticas, em um modelo apropriado, pode-se avaliar a farmacocinética, a farmacodinâmica e a eficácia da terapêutica.
