Ce protocole permet la livraison directe de thérapeutiques dans le système nerveux central du rat pour évaluer la pharmacocinétique, la pharmacodynamique et l’efficacité de nouvelles thérapeutiques dans les modèles de maladies du rat. Cette procédure est sûre, efficace et ne nécessite pas d’équipement coûteux ou d’outils chirurgicaux. Yi Chen et Yi Luo, chercheurs de mon laboratoire, démontreront la procédure.
Pour préparer le guide spécial cannulas, utilisez un outil rotatif avec une roue coupée pour couper les deux extrémités d’une aiguille de calibre 19 pour obtenir une canule guide d’environ un mètre et demi à deux centimètres de long. Ensuite, utilisez la meule de l’outil rotatif pour lisser les deux extrémités. Pour préparer l’assemblage du fil de cathéter, couper un morceau de huit centimètres de long de tube PE10 de 011 pouces de diamètre pour servir de cathéter intrathecal pour chaque animal.
Utilisez un stylo marqueur résistant à l’éthanol pour marquer deux centimètres d’une extrémité de chaque morceau de tube. Pour chaque animal, insérez un fil de stylet de 11 centimètres de long coupé à partir de fil en acier inoxydable recouvert de polytétrafluoroéthylène dans le lumen du cathéter PE10 de huit centimètres. Pour préparer l’assemblage du cathéter de livraison, couper un morceau de cathéter PE50 de 5 à 10 centimètres de diamètre et insérer un adaptateur de tubes de calibre 23 dans une extrémité du cathéter.
Insérez ensuite une aiguille de calibre 30 avec un moyeu coupé dans un morceau d’environ 0,5 centimètre de tube PE10 et connectez le tube PE10 à l’autre extrémité du cathéter. Pour préparer un assemblage guide canule-aiguille, placez une canule guide au-dessus de l’extrémité d’une aiguille de calibre 23. Avant de commencer la chirurgie, placez un coussin chauffant sur la table de chirurgie et couvrez le coussin avec une feuille de drapé stérile.
Placez un tube de centrifugeuse conique de 50 mL sur la feuille et confirmez un manque de réponse au pincement des pieds chez le rat expérimental anesthésié. Après avoir pesé l’animal, raser le dos de la queue à la colonne thoracique caudale et placer le rat rasé sur la feuille stérile en position couchée. Placez le tube de 50mL sous l’abdomen pour fléchir la colonne vertébrale dans la région lombaire, et appliquez l’onguent ophtalmique aux yeux.
Ensuite, injectez subcutanément un milligramme par kilogramme de buprénorphine à libération soutenue et nettoyez la peau exposée avec de la povidone séquentielle et des gommages d’alcool. Draper l’animal d’une feuille transparente stérile fenestrated. Pour le placement du cathéter et l’injection du composé, identifier les deux fosses naturelles entre les muscles au-dessus du bassin rasé, et avec une main tenant les fosses, utilisez l’autre main pour appuyer doucement et sentir la colonne vertébrale du caudal à la direction rostrale pour localiser la première indentation majeure entre les vertèbres.
Après avoir identifié l’espace intervertébral entre les vertèbres S1 et L6, déplacez-vous légèrement rostrally pour identifier l’espace intervertébral entre les vertèbres L5 et L6. Utilisez un scalpel pour faire une incision d’au plus deux centimètres de long dans la peau et la capsule musculaire à cet endroit le long de la ligne médiane de la direction rostrale à caudale de sorte que le site d’injection sera au centre de l’incision. Utilisez des ciseaux de dissection pour disséquer le tissu conjonctif jusqu’à ce que la couche musculaire puisse être visualisée.
Faire une incision d’un centimètre dans la capsule musculaire immédiatement latérale au processus spinal dorsal de la vertèbre lombaire L6. Placez l’assemblage de l’aiguille de canule guide près de l’aspect antérieur de la sixième vertèbre lombaire et poussez l’assemblage dans l’espace intervertébral le long de l’aspect antérieur de la sixième vertèbre de sorte que l’extrémité de l’aiguille pénètre dans le canal rachidien. Utilisez des forceps contondants pour localiser le processus rachidien dorsal de la vertèbre lombaire L6 puis poussez l’aiguille le long de l’aspect antérieur de la sixième vertèbre dans l’espace des invertébraux.
Poussez la canule guide en place le long de l’aiguille, retirez l’aiguille et insérez l’assemblage du fil de cathéter dans la canule du guide. La pêche au cathéter à un angle d’environ 45 degrés vers le canal rachidien force l’extrémité du cathéter à environ 0,3 centimètre dans le canal. Retirez le fil de stylet à environ 2,5 centimètres de la pointe intrathecale du cathéter et avancez le cathéter dans le canal rachidien jusqu’à ce que le marquage de deux centimètres sur le cathéter soit juste visible sous le muscle.
Lorsque le cathéter est en place, retirez la canule guide pour laisser le cathéter et le fil de stylet en place. Avancez le cathéter dans le canal rachidien jusqu’à ce que la marque de deux centimètres soit à l’entrée du canal et retirez complètement le fil de stylet. Le liquide céphalo-rachidien peut être visualisé entrant dans le cathéter implanté.
Connectez ensuite l’assemblage du cathéter de livraison à l’extrémité distale du cathéter implanté par l’intermédiaire de l’extrémité de l’aiguille de calibre 30. Ensuite, chargez 60 microlitres de solution saline stérile dans une seringue de 100 microlitres et chargez un bolus de 30 microlitres du composé d’essai dans une deuxième seringue. Connectez la seringue saline à l’extrémité de l’adaptateur de tubes de l’assemblage du cathéter de livraison et rincez 20 microlitres de solution saline stérile dans l’espace intrathecal.
Lorsque toute la solution saline a été rincée, remplacez la seringue saline par la seringue chargée bolus et injectez 30 microlitres du composé d’essai dans l’espace intrathécal sur une période de 30 secondes. Lorsque tout le bolus a été livré, remplacer la seringue chargée de bolus par une autre seringue saline chargée et rincer le cathéter avec 40 microlitres supplémentaires de solution saline. Lorsque le deuxième volume de solution saline a été livré, détachez l’assemblage du cathéter de livraison du cathéter implanté et utilisez une paire de forceps de dissection stérilisés par la chaleur très chaude pour sévir contre le tube pour couper et sceller à la chaleur le cathéter implanté.
Utilisez des sutures de monofilament absorbables pour fixer le cathéter scellé à la chaleur vers le tissu conjonctif, puis utilisez des sutures non absorbables pour fermer la peau. Ensuite, utilisez de la gaze et de la solution saline pour laver le sang de la peau et placer le rat dans un incubateur chauffé avec surveillance jusqu’à la pleine récomprégence. Dans cette expérience représentative, le knockdown très bon a été obtenu dans toutes les régions rassemblées après la livraison unique d’oligonucléotide de bolus antisense comme démontré.
Cependant, un certain degré de variabilité régionale a été mesuré avec la moelle épinière présentant le pourcentage le plus élevé de knockdown. Après une injection réussie de l’oligonucléotide antisens, ou d’autres thérapeutiques, dans un modèle approprié, on peut évaluer la pharmacocinétique, la pharmacodynamique, et l’efficacité des thérapeutiques.
