이 프로토콜은 쥐의 중추 신경계에 치료제를 직접 전달하여 쥐 질병 모델에서 약동학, 약물 역학 및 새로운 치료법의 효능을 평가할 수 있습니다. 이 절차는 안전하고 효과적이며 고가의 장비 또는 수술 도구가 필요하지 않습니다. 이 절차를 시연하는 것은 이첸과 이루오, 내 실험실에서 연구 과학자가 될 것입니다.
특별 가이드 캐뉼라를 준비하려면 휠이 잘린 로터리 도구를 사용하여 19 게이지 바늘의 양쪽 끝을 잘라 약 1~2센티미터 길이가이드 캐뉼라를 얻습니다. 그런 다음 로터리 공구의 연삭 휠을 사용하여 양쪽 끝을 부드럽게 합니다. 카테터 와이어 조립을 준비하려면 각 동물의 인트라테칼 카테터 역할을 하기 위해 직경 011인치 PE10 튜브의 8센티미터 길이의 PE10 튜브를 잘라냅니다.
에탄올 내성 마커 펜을 사용하여 각 튜브의 한쪽 끝에서 2센티미터 의 마크를 만듭니다. 각 동물에 대해, 8센티미터 PE10 카테터의 루멘에 폴리테트라플루오로틸렌 코팅 스테인리스 스틸 와이어에서 절단 된 11 센티미터 긴 스타일 와이어를 삽입합니다. 배달 카테터 조립을 준비하려면 직경 5~10cm 023인치 PE50 카테터를 자르고 23게이지 튜브 어댑터를 카테터의 한쪽 끝에 삽입합니다.
그런 다음 허브가 잘려낸 30 게이지 바늘을 PE10 튜브의 약 0.5센티미터 조각으로 잘라내고 PE10 튜브를 카테터의 다른 쪽 끝에 연결합니다. 가이드 캐뉼라 바늘 조립을 준비하려면 23 게이지 바늘 끝에 가이드 캐뉼라를 놓습니다. 수술을 시작하기 전에 수술 테이블에 가열 패드를 놓고 멸균 드레이프 시트로 패드를 덮습니다.
시트에 50mL 원심분리기 튜브를 놓고 마취된 실험 쥐의 발가락 핀치에 대한 반응부족을 확인한다. 동물의 무게를 측정 한 후, 꼬리에서 caudal 흉부 척추에 뒷면을 면도하고 경향이 위치에 멸균 시트에 면도 쥐를 배치합니다. 50mL 튜브를 복부 아래에 배치하여 요추 부위의 척추를 구부리고 안과 연고를 눈에 바릅니다.
다음으로, 피하하여 1킬로그램당 1밀리그램의 지속적인 방출 부프레노르핀을 주입하고 순차적인 포비도네와 알코올 스크럽으로 노출된 피부를 청소합니다. 펜에스트처리된 멸균 투명 시트로 동물을 드레이프합니다. 카테터의 배치및 화합물의 주입을 위해, 면도 골반 위의 근육 사이의 두 가지 천연 구덩이를 식별하고, 한 손으로 구덩이를 잡고, 부드럽게 누르고 척추 사이의 첫 번째 주요 들여쓰기를 찾기 위해 로스트랄 방향으로 코달에서 척추를 느낄 수있는 다른 손을 사용합니다.
S1과 L6 척추 사이의 무척추 동물 공간을 식별 한 후 약간 장밋빛으로 움직여 L5와 L6 척추 사이의 추간판 공간을 식별하십시오. 메스를 사용하여 로스트랄에서 코달 방향으로 중간선을 따라 이 부위의 피부와 근육 캡슐에 2센티미터 이상의 긴 절개를 하여 주사 부위가 절개의 중심에 있게 한다. 해부 가위를 사용하여 근육 층이 시각화 될 때까지 결합 조직을 해부하십시오.
L6 요추 척추의 등쪽 척추 과정에 즉시 근육 캡슐에 1 센티미터 절개를합니다. 제6요추 척추의 전방 측면 근처에 가이드 캐뉼라 바늘 조립을 배치하고 바늘의 끝이 척추 운하에 침투할 수 있도록 여섯 번째 척추의 전방 측면을 따라 추간판 공간으로 어셈블리를 밀어 넣습니다. 무딘 집게를 사용하여 L6 요추 척추의 등쪽 척추 과정을 찾은 다음 여섯 번째 척추의 전방 측면을 따라 바늘을 구산구 공간으로 밀어 넣습니다.
가이드 캐뉼라를 바늘을 따라 제자리에 밀어 넣고 바늘을 제거하고 카테터 와이어 어셈블리를 가이드 캐뉼라에 삽입합니다. 카테터를 척추 운하에 약 45도 각도로 기울여 카테터의 끝을 운하로 약 0.3cm 밀어 넣습니다. 카테터의 내트라테칼 끝에서 약 2.5센티미터의 스타일 와이어를 제거하고 카테터의 2센티미터 표시가 근육 아래에 보일 때까지 카테터를 척추 운하로 전진시다.
카테터가 제자리에 있을 때 가이드 캐뉼라를 제거하여 카테터와 스타일 와이어를 제자리에 놓습니다. 카테터를 척추 운하로 진출하여 두 센티미터 표시가 운하 입구에 있고 스타일 와이어를 완전히 철회할 때까지 진행합니다. 대뇌 척수액은 이식된 카테터에 들어가는 것을 시각화할 수 있다.
그런 다음 30 게이지 바늘 끝을 통해 이식 된 카테터의 단면 끝에 전달 카테터 어셈블리를 연결합니다. 다음으로, 멸균 식염수 60마이크로리터를 100 마이크로리터 주사기에 적재하고 시험 화합물의 30 마이크로리터를 두 번째 주사기로 로드합니다. 식염수 주사기를 전달 카테터 조립의 튜브 어댑터 끝에 연결하고 멸균 식염수 20 마이크로리터를 내트라테칼 공간으로 플러시합니다.
식염수의 모든 플러시 된 경우, 식염수 주사기를 볼러스로드 주사기로 교체하고 30 초 동안 인트라 테칼 공간에 테스트 화합물의 30 마이크로 리터를 주입. 모든 볼러스가 전달되면 볼루스로드 주사기를 다른 식염수로드 주사기로 교체하고 카테터를 식염수 40 마이크로리터로 플러시합니다. 식염수의 두 번째 부피가 전달되면, 이식 된 카테터에서 배달 카테터 어셈블리를 분리하고 매우 뜨거운 열 살균 해부 집게 한 쌍을 사용하여 튜브를 고정하여 절단하고 이식 된 카테터를 열 밀봉합니다.
흡수성 모노필라멘트 봉합사를 사용하여 열 밀봉 카테터를 결합 조직에 고정한 다음 흡수할 수 없는 봉합사를 사용하여 피부를 닫습니다. 그런 다음 거즈와 식염수로 피부의 혈액을 씻고 쥐를 완전한 보상이 될 때까지 모니터링하여 가열 된 인큐베이터에 놓습니다. 본 대표적인 실험에서, 단일 볼루스 안티센스 올리고뉴클레오티드 전달 후 수집된 모든 지역에서 매우 양호한 녹다운을 얻어낸 바와 같이.
그러나, 어느 정도의 지역 적 변동성은 척수로 측정되어 가장 높은 백분율의 녹다운을 나타냈다. 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 기타 치료제를 성공적으로 주입한 후 적절한 모델로, 약물역학, 약물역학 및 치료제의 효능을 평가할 수 있다.
