Agradecemos a Bernard Charroux para as discussões. Este trabalho foi financiado pela Escola KCL Biomédica.

1. Dissecção da retina Drosophila <ol><li> Preencher um poço de uma lâmina de vidro 3-Bem com tampão fosfato salina (PBS 1X), e depois anestesiar voa de CO 2. Os machos e as fêmeas podem ser utilizados para este experimento. </li><li> Uma vez que as moscas são anestesiados, pegar uma única mosca usando uma pinça e solte-o no prato pequeno de PBS. </li><li> De acordo com um escopo de dissecação, aperte a tromba com uma pinça, e depois retirar a cabeça do corpo, cortando o pescoço com um segundo conjunto de fórceps. </li><li> Segurando a cabeça voar a partir do proboscis, cortado pela metade ao longo da linha média esquerda / direita a cabeça voar com microtesoura para revelar o cérebro. </li><li> Use uma ponteira de corte para pegar a retina, e transferir para um segundo poço da lâmina de vidro 3-Bem cheio com meio Schneider. </li><li> Primeiro, descascar mais da cutícula cabeça e em seguida, retire o cérebro com uma pinça. Manter a retina colada entre a lâmina ea córnea. </li><li> Em seguida, transferir a retina em uma gota (50 ul) de médio Schnieder fresco colocado diretamente da lâmina de vidro. </li></ol> 2. Dissecção da omatídeos <ol><li> Dependendo do objetivo final da dissecção (se a imagem imediata ou cultura) e na óptica do microscópio de fluorescência (direto ou invertido), esta etapa pode ter lugar numa lâmina de microscópio ou uma placa de 24 poços. Para o objectivo final desta dissecção, a omatídeos serão dissecados diretamente sobre a lâmina de vidro. </li><li> Compreender tanto o fim mais dorsal ou ventral da retina com uma pinça. Usando microtesoura, corte a retina na metade ao longo da linha média dorsal / ventral para expor os omatídeos no meio do olho. </li><li> Continuar a se agarrar a retina de tal forma que a córnea é voltado para baixo ea lâmina é virada para cima. Usando uma agulha de tungstênio fino, retire o omatídeos da lâmina e da córnea. </li><li> Omatídeos individuais e grupos de omatídeos irá recolher no fundo do poço ou slide. Remova todos os maiores detritos que possam ter recolhido antes de prosseguir. </li></ol> 3. Coloração, tratamento e imagem <ol><li> Para analisar a autofagia, diluir 1:1000 Lyso Tracker na queda Schneider (primeiro diluir 1:10 em Schneider e adicione 0,5 mL para a queda no slide), misture e aguarde 10 segundos. </li><li> Retire o excesso de líquido a partir do slide, tendo o cuidado de deixar para trás o omatídeos. Este é o melhor feito com uma ponta fina de gel loading. </li><li> Adicionar uma gota de Vectashield para cobrir os omatídeos, cobrir com uma lamela e selar com verniz. </li></ol> 4. Resultados representativos: A boa execução do protocolo deve deixar um número de omatídeos individuais e de pequenos grupos de omatídeos mantidos juntos por fragmentos de lâmina, mas bem separada do lado da córnea. Estes podem ser visualizados como neste exemplo para visualizar Atg8: GFP e Lyso Tracker, mostrando autofagossomas, lisossomos e autophagolysosomes (Fig. 3). O método pode ser usado para geração de imagens ao vivo, no entanto, neste caso, é de notar que a autofluorescência de meio Schneider fará com que seja difícil de distinguir os sinais de baixa intensidade fluorescente. Um problema adicional é que os grânulos de pigmento que permanecer solidários com os fotorreceptores são intensamente fluorescentes, especialmente no canal vermelho. Uma imagem de campo claro pode ser necessária para distingui-las das organelas genuíno. <img src="/files/ftp_upload/2882/2882fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Fluxograma do procedimento de dissecção para obter omatídeos individuais ou pequenos grupos de omatídeos da retina voar. <img src="/files/ftp_upload/2882/2882fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Variações possíveis do protocolo simples descrevem que envolvem genética da mosca e envelhecimento upstream da dissecção e coloração ou cultura para até 24 horas ea jusante de drogas de administração da dissecção. <img src="/files/ftp_upload/2882/2882fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3 varredura confocal de autofagossomas e lisossomos em um único omatídeo dissecados de aw; GMR-Gal4, UAS-Atro75QN; UAS-GFP:.: Atg8 / fly +, expressando uma poliglutaminas Atrophin mutante e com idades entre 12 dias a 29 ° C. O painel de campo claro (à direita) exibe a estrutura quase intacta da omatídeo eo quadro indica a área digitalizada. Os lisossomos marcas vermelhas, verdes do autofagossomas, auto-lisossomos, resultando pela fusão das duas organelas, aparecem amarelo. Das setas indicam dois eventos de fusão em curso entre autofagossomas e lisossomos.

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	<li>Marsh, J. L., Thompson, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+in+the+study+of+neurodegenerative+disease.">Drosophila in the study of neurodegenerative disease.</a> Neuron. 52, 169-178 (2006).</li><li>Mizushima, N., Levine, B., Cuervo, A. M., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+fights+disease+through+cellular+self-digestion.">Autophagy fights disease through cellular self-digestion.</a> Nature. 451, 1069-1075 (2008).</li><li>Nisoli, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurodegeneration+by+polyglutamine+Atrophin+is+not+rescued+by+induction+of+autophagy.">Neurodegeneration by polyglutamine Atrophin is not rescued by induction of autophagy.</a> Cell Death Differ. 17, 1577-1587 (2010).</li><li>Charroux, B., Fanto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fine+line+between+waste+disposal+and+recycling:+DRPLA+fly+models+illustrate+the+importance+of+completing+the+autophagy+cycle+for+rescuing+neurodegeneration.">The fine line between waste disposal and recycling: DRPLA fly models illustrate the importance of completing the autophagy cycle for rescuing neurodegeneration.</a> Autophagy. 6, 667-669 (2010).</li><li>Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-sensitive+potassium+channels+in+Drosophila+photoreceptors.">Voltage-sensitive potassium channels in Drosophila photoreceptors.</a> J Neurosci. 11, 3079-3095 (1991).</li><li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+(MARCM)+for+Drosophila+neural+development.">Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development.</a> Trends in neurosciences. 24, 251-254 (2001).</li><li>Xu, T., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+genetic+mosaics+in+developing+and+adult+Drosophila+tissues.">Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues.</a> Development. 117, 1223-1237 (1993).</li><li>Gambis, A., Dourlen, P., Steller, H., Mollereau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-color+in+vivo+imaging+of+photoreceptor+apoptosis+and+development+in+Drosophila.">Two-color in vivo imaging of photoreceptor apoptosis and development in Drosophila.</a> Dev Biol. 351, 128-1234 (2011).</li><li>Napoletano, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyglutamine+Atrophin+provokes+neurodegeneration+in+Drosophila+by+repressing+fat.">Polyglutamine Atrophin provokes neurodegeneration in Drosophila by repressing fat.</a> The EMBO journal. 30, 945-958 (2011).</li><li>Ravikumar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+mTOR+induces+autophagy+and+reduces+toxicity+of+polyglutamine+expansions+in+fly+and+mouse+models+of+Huntington+disease.">Inhibition of mTOR induces autophagy and reduces toxicity of polyglutamine expansions in fly and mouse models of Huntington disease.</a> Nature. 36, 585-595 (2004).</li><li>Zou, S., Meadows, S., Sharp, L., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+study+of+aging+and+oxidative+stress+response+in+Drosophila+melanogaster.">Genome-wide study of aging and oxidative stress response in Drosophila melanogaster.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 13726-13731 (2000).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

A dissecção omatídeo única apresentada aqui permite a coleta de informações mais profundas sobre os processos biológicos celulares, como neurodegeneração, quando modelada no olho Drosophila. Os neurônios fotorreceptores são mais facilmente acessível do que outros neurônios e eles citoplasma é particularmente grande, e, portanto, adequado para estudar a dinâmica da vesícula, nas células mesma usada eficientemente em muitos modelos para quantificar neurodegeneração in vivo. O aspecto c...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários (opcional) </th></tr><tr><td> Dispenser CO2 portáteis </td><td> Flystuff </td><td> 59-150 </td><td> Recargas também está disponível </td></tr><tr><td> DUMONT Tweezer n º 5 </td><td> AGAR Scientific </td><td> T5034 </td><td></td></tr><tr><td> 3-Bem lâmina de vidro </td><td> EMS </td><td> 71561-01 </td><td></td></tr><tr><td> Micro tesoura </td><td> VWR </td><td> HAMMHSB516-09 </td><td></td></tr><tr><td> Médio Schneider </td><td> VWR </td><td> 733-1663 </td><td></td></tr><tr><td> Lyso Tracker Red DND-99 </td><td> Invitrogen </td><td> L7528 </td><td></td></tr><tr><td> Slides Superfrost </td><td> VWR </td><td> 631-0108 </td><td></td></tr><tr><td> Vectashield com DAPI </td><td> Vector Labs </td><td> H-1200 </td><td></td></tr><tr><td> Lamínulas </td><td> VWR </td><td> 631-1336 </td><td></td></tr></tbody></table>

single drosophila ommatidium dissection and imaging

A mosca da fruta Drosophila melanogaster fez contribuições inestimáveis ​​para pesquisa em neurociência e tem sido amplamente utilizado como modelo para doenças neurodegenerativas por causa de sua genética poderosa 1. O olho da mosca em particular, tem sido o órgão de escolha para a pesquisa neurodegeneração, sendo a parte mais acessível e de vida dispensáveis ​​do sistema nervoso Drosophila. No entanto, a ressalva importante de olhos intactos é a dificuldade, por causa da intensa autofluorescência do pigmento, em eventos intracelulares de imagem, como a autofagia dinâmica 2, que são fundamentais para a compreensão da neurodegeneração. Temos utilizado recentemente a dissecção ea cultura de omatídeos única 3 que tem sido essencial para a nossa compreensão das disfunções autofágica em um modelo de voar (DRPLA) 3 de Dentatorubro-Pallidoluysian Atrofia, 4. Temos agora um relatório de descrição abrangente dessa técnica (Fig. 1), adaptado de estudos eletrofisiológicos 5, que é provável expandir dramaticamente a possibilidade de voar por modelos neurodegeneração. Este método pode ser adaptado a imagem ao vivo de eventos subcelulares e para monitorar a administração da droga eficaz para células fotorreceptoras (Fig. 2). Se usado em combinação com técnicas de mosaico 6-8, as respostas das células geneticamente diferentes podem ser testadas em paralelo (Fig. 2).

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Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

O fator limitante no uso do adulto<em&gt; Drosophila</em&gt; Olho para estudar neurodegeneração e biologia celular é a imagem difícil de processos intracelulares. Descrevemos a dissecação de omatídeos única para gerar uma boa-fé de cultura de células neuronais primários, que podem ser sujeitos a tratamento medicamentoso e avançados de imagem.

Único Drosophila Dissection omatídeo e Imagem

The fruit fly Drosophila melanogaster has made invaluable contributions to neuroscience research and has been used widely as a model for neurodegenerative ...

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Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

13.9K visualizações.  King's College London. O fator limitante no uso do adulto Drosophila Olho para estudar neurodegeneração e biologia celular é a imagem difícil de processos intracelulares. Descrevemos a dissecação de omatídeos única para gerar uma boa-fé de cultura de células neuronais primários, que podem ser sujeitos a tratamento medicamentoso e avançados de imagem.