Otimizamos um método altamente qualificado e clinicamente aplicável para a expansão de células T assassinas induzidas por citocinas derivadas do PBMC e para avaliação de sua citotoxicidade contra cânceres. A vantagem desta técnica é fornecer um procedimento operacional padrão para técnicos e médicos quantificarem a potência das células assassinas induzidas por citocinas tanto na pesquisa científica quanto na avaliação clínica. Inicie este procedimento com uma preparação de células CIK como descrito no protocolo de texto, em seguida, lave as células CIK com 10 mililitros de PBS estéreis.
Centrífuga por 10 minutos a 300 vezes G e 18 a 20 graus Celsius. Aspire o supernasce e resuspende as células com cinco mililitros de PBS. Conte os números de células e teste a viabilidade celular usando o ensaio de exclusão azul trypan.
Alíquota as células CIK em seis tubos estéreis de 1,5 mililitros a uma densidade de aproximadamente 5 a um milhão de células por mililitro de PBS. Rotule e trate as células como detalhadas no protocolo de texto. Misture suavemente as células CIK com os anticorpos, escrutendo suavemente para cima e para baixo pelo menos três vezes com uma pipeta estéril de um mililitro.
Incubar as células por 15 minutos à temperatura ambiente no escuro. Centrifugar os tubos por 10 minutos a 300 vezes G e 18 a 20 graus Celsius. Após a centrifugação, aspire o supernaspe e resuspense a pelota celular com um mililitro de PBS, em seguida, gentilmente pipetar as células para cima e para baixo pelo menos três vezes com uma pipeta estéril de um mililitro.
Transfira a suspensão celular para um tubo inferior redondo de cinco mililitros de poliestireno com uma tampa de coador celular, tubos suavemente através da tampa, em seguida, coloque os tubos no carrossel em ordem. Abra o software de análise de citometria de fluxo e crie uma pasta experimental e clique no novo botão de espécime para adicionar um espécime e um tubo ao experimento. Nomeie os tubos conforme listado no protocolo de texto.
Para criar um sistema de gating de dispersão para as populações de células CIK, selecione primeiro o tubo um e clique no botão de plot de ponto para criar um gráfico FSCA SSCA. Desenhe um portão de retângulo sobre toda a população celular com um limiar FSCA maior que 5000 para excluir detritos celulares. Selecione o parâmetro FSCA FSCH para o novo gráfico de pontos e desenhe um portão de polígono em todas as células.
Selecione a contagem versus CD3 conjugado pelo FITC e conte contra o parâmetro CD56 conjugado pelo APC para o novo enredo de histograma. Selecione o parâmetro CD3 conjugado pelo FITC versus CD56 conjugado a APC para o novo gráfico de pontos e desenhe um portão de quatro quadrantes para definir as quatro subpopulações. Registo os dados de 20.000 células individuais em cada espécime.
Clique no botão de amostra de carga para analisar primeiro a amostra de controle em branco. Identifique toda a população celular CIK usando os parâmetros do canal CD56 e CD3. Abra os arquivos contendo os valores estatísticos da amostra individual para analisar populações de células CIK e reimprimi-las em arquivos de análise.
Para realizar o ensaio citotóxico, cik de cocultura e células de leucemia mielóide crônica humana K562 adicionando um mililitro de células K562 a cada poço em uma placa de seis poços a uma densidade de 5 milhões de células por mililitro, em seguida, adicione um mililitro de meio basal com ou sem células CIK à placa de seis poços como listado no protocolo de texto. Misture as suspensões celulares ao escoar suavemente pelo menos três vezes. Coloque a placa na incubadora por 24 horas.
Agora, cocultura CIK e células OC-3 ovarianas adicionando um mililitro de meio basal com ou sem células CIK à placa de seis poços, conforme listado no protocolo de texto. Misture as suspensões celulares ao escoar suavemente pelo menos três vezes. Coloque a placa na incubadora por 24 horas.
Após a incubação, colde a suspensão celular CIK K562 diretamente em um tubo estéril de 15 mililitros. Para colher as células de suspensão e adesão dos grupos CIK OC-3, primeiro transfira a suspensão celular para um tubo estéril de 15 mililitros. Lave o poço com um mililitro de PBS estéril, colete o PBS e adicione-o ao tubo, depois adicione 5 mililitros de solução de enzima de dissociação celular e incubar por cinco minutos a 37 graus Celsius.
Adicione um mililitro da solução do mesmo tubo ao poço correspondente, e misture suavemente as células por tubos para cima e para baixo pelo menos três vezes com uma pipeta estéril de um mililitro. Colete todas as células no mesmo tubo. Centrifugar a 300 vezes G por 10 minutos.
Aspire o supernasce e resuspende as células em um mililitro de PBS estéril. Pelotar as células a 300 vezes G por 10 minutos, depois aspirar o supernascer e resuspensar as células em 100 microliters de PBS estéril. Adicione cinco microliters de corante 7-AAD à suspensão celular.
Misture suavemente as células por pipetar para cima e para baixo pelo menos três vezes com uma pipeta estéril de um mililitro. Incubar por 10 minutos e deixar no escuro antes da análise. Para realizar o ensaio de capacidade citólítica, misture a suspensão celular e repita a preparação para citometria de fluxo.
Clique no novo botão de espécime para adicionar um espécime e um tubo ao experimento. Nomeie os tubos conforme listado no protocolo de texto. Para criar um sistema de gating de dispersão para o ensaio citólítico, selecione primeiro o tubo um e clique no botão de plot de ponto para criar um gráfico FSCA SSCA.
Desenhe um portão de retângulo sobre todos os eventos com um limiar FSCA superior a 50.000 para excluir detritos celulares. Selecione o parâmetro SSCA CFSE para o novo gráfico de pontos e selecione o parâmetro CFSE 7-AAD para o novo gráfico de pontos e desenhe um portão de quatro quadrantes para definir as quatro subpopulações. Clique no botão de amostra de carga para analisar primeiro a amostra de controle em branco.
Ajuste a tensão do SSCA e do FSCA. Identifique a população de células mortas usando os parâmetros do canal CFSE e 7-AAD. Registo os dados de células positivas de maiores de 20.000 CFSE em cada amostra.
Abra os arquivos contendo os valores estatísticos de cada amostra individual para analisar as populações celulares não viáveis e exporte os dados para arquivos de análise. Os resultados representativos da estratégia de gating para análise da subpopulação de células T positivas CD56 do CD56 positivo de doadores saudáveis são mostrados com a análise estatística da proporção CIK de três indivíduos. A proporção positiva de células CD56 do CD-3 aumentou significativamente após 14 dias de expansão.
Isso é evidente através dos 65% para o PBMC original que aumentou para 27,4% para as células CIK colhidas no dia 14. Neste sistema de cultura, as células CIK produziram cerca de meia centena de mudanças em comparação com o número original de PBMCs. As células K562 foram manchadas com um corante não fluorescente CFSE, que é cortado por esterases intracelulares dentro de células viáveis e se torna um corante altamente fluorescente.
O tamanho e a granularidade das células CIK e CFSE positivos são ilustrados. As células K562 manchadas de CFSE foram cotratadas com células CIK em uma proporção de zero a um, cinco para um, e 10 para um. Estas células foram manchadas com corante 7-AAD como uma sonda de viabilidade para exclusão de células mortas.
As células positivas 7-AAD das células K562 positivas cfse foram todas avaliadas. As células OC-3 manchadas de CFSE foram co-tratadas com células CIK a uma proporção de 10 para 1. A óbvia citotoxicidade do CIK contra células OC-3 é demonstrada aqui após 24 horas de incubação.
As células T cik tem sido relatada para exercer efeitos citotóxicos significativos contra as células cancerosas e reduzir os efeitos adversos da cirurgia, radiação e quimioterapia em tratamentos de câncer. A imunoterapia é um tratamento promissor para uma série de cânceres. O CIK pode ser expandido eficientemente in vitro por incubação de PMBCs derivados do paciente em condição de grau GMP para infusão mais autóloga.
Seguindo este protocolo, poderíamos executar a terapia celular imune em uma instalação de grau GTP ou GMP para mais tratamento clínico de câncer.
