PBMC kaynaklı sitokin kaynaklı katil T hücrelerinin genişlemesi ve kanserlere karşı sitotoksisitelerinin değerlendirilmesi için yüksek nitelikli ve klinik olarak uygulanabilir bir yöntemi optimize ettik. Bu tekniğin avantajı, hem bilimsel araştırma hem de klinik değerlendirmede sitokin kaynaklı öldürücü hücrelerin gücünü ölçmek için teknisyenler ve klinisyenler için standart bir işletim prosedürü sağlamaktır. Bu yordamı metin protokolünde açıklandığı gibi CIK hücrelerinin hazırlanmasıyla başlayın, ardından CIK hücrelerini 10 mililitre steril PBS ile yıkayın.
Santrifüj 300 kez G ve 18-20 santigrat derece 10 dakika. Supernatant aspire ve PBS beş mililitre ile hücreleri resuspend. Trypan mavi dışlama testini kullanarak hücre numaralarını ve test hücrecanlılığını sayın.
Aliquot CIK hücreleri altı steril 1.5 mililitre tüpler pBS mililitre başına yaklaşık 5 ila bir milyon hücre yoğunluğu. Metin protokolünde ayrıntılı olarak hücreleri etiketleyin ve tedavi edin. Cik hücrelerini en az üç kez bir mililitrelik steril pipetle hafifçe yukarı ve aşağı borulandırarak antikorlarla hafifçe karıştırın.
Karanlıkta oda sıcaklığında hücreleri 15 dakika kuluçkaya yatırın. Tüpleri 300 kez G ve 18-20 santigrat derecede 10 dakika santrifüj edin. Santrifüjden sonra, süpernatant aspire ve PBS bir mililitre ile hücre pelet resuspend, sonra yavaşça bir mililitre steril pipet ile en az üç kez hücreleri pipet.
Hücre süspansiyonunu steril beş mililitrelik polistiren yuvarlak alt tüpe aktarın ve bir hücre süzgeci kapağı ile kapağı hafifçe borulayarak, sonra tüpleri sırayla atlıkarıncaya yerleştirin. Akış sitometri sitometrisi analiz yazılımını açın ve deneysel bir klasör oluşturun, ardından deneye bir örnek ve tüp eklemek için yeni numune düğmesini tıklatın. Metin protokolünde listelenen tüpleri adlandırın.
CIK hücre popülasyonları için bir dağılım gating sistemi oluşturmak için, önce tüp bir seçin ve bir FSCA SSCA çizimi oluşturmak için nokta çizim düğmesine tıklayın. Hücre enkazını dışlamak için FSCA eşiği 5000'den büyük olan tüm hücre popülasyonuna dikdörtgen bir geçit çizin. Yeni nokta çizimi için FSCA FSCH parametresini seçin ve tüm tek hücrelerin etrafına bir çokgen kapısı çizin.
Yeni histogram çizimi için FITC konjuge CD3'e karşı sayım ve APC konjuge CD56 parametresine karşı sayma seçeneğini belirleyin. Yeni nokta çizimi için FITC konjuge CD3 ile APC konjuge CD56 parametresini seçin ve dört alt popülasyonu tanımlamak için dört bir çeyrek kapısı çizin. Her numunedeki 20.000 tek hücreden gelen verileri kaydedin.
Önce boş kontrol örneğini analiz etmek için yük örneği düğmesini tıklatın. CD56 ve CD3 kanal parametrelerini kullanarak tüm CIK hücre popülasyonunu tanımlayın. CIK hücre popülasyonlarını analiz etmek ve analiz dosyalarına yeniden yazdırmak için tek tek numunenin istatistiksel değerlerini içeren dosyaları açın.
Sitotoksik titreci, coculture CIK ve insan kronik miyeloid lösemi K562 hücrelerini, her bir kuyuya mililitre K562 hücrelerini mililitrelik bir yoğunlukta, mililitre başına 5 milyon hücre ye ekleyerek gerçekleştirmek için, daha sonra altı kuyulu plakaya CIK hücreleri veya CIK hücresi olmayan bir mililitre bazal ortam ekleyin. Hücre süspansiyonlarını en az üç kez hafifçe yukarı ve aşağı boruile karıştırarak karıştırın. Plakayı 24 saat boyunca kuvöze yerleştirin.
Şimdi, coculture CIK ve yumurtalık OC-3 hücreleri altı iyi plaka olarak metin protokolü listelenen veya CIK hücreleri olmadan bazal orta bir mililitre ekleyerek. Hücre süspansiyonlarını en az üç kez hafifçe yukarı ve aşağı boruile karıştırarak karıştırın. Tabağı 24 saat boyunca kuvöze koy.
Kuluçkadan sonra CIK K562 hücre süspansiyonunu doğrudan 15 mililitrelik steril bir tüpe dönüştürün. CIK OC-3 gruplarından hem süspansiyon hem de yapışma hücrelerini hasat etmek için, önce hücre süspansiyonuna 15 mililitrelik steril tüp aktarın. Steril PBS bir mililitre ile iyi yıkayın, PBS toplamak ve tüp ekleyebilirsiniz, sonra hücre ayrıştırma enzim çözeltisi 5 mililitre ekleyin ve 37 santigrat derece beş dakika kuluçka.
Çözeltinin bir mililitresini aynı tüpten ilgili kuyuya ekleyin ve hücreleri en az üç kez bir mililitresteril pipetle karıştırarak hafifçe karıştırın. Aynı tüp tüm hücreleri toplamak. 10 dakika boyunca 300 kez G santrifüj.
Supernatant aspire ve steril PBS bir mililitre hücreleri resuspend. 10 dakika boyunca 300 kez G'deki hücreleri peletleyin, sonra süpernatantı aspire edin ve 100 mikrolitre steril PBS'de hücreleri yeniden askıya alın. Hücre süspansiyonuna beş mikrolitre 7-AAD boya ekleyin.
Bir mililitresteril pipet ile en az üç kez yukarı ve aşağı boru ile hücreleri yavaşça karıştırın. 10 dakika kuluçkaya yat ve analizden önce karanlıkta bırak. Sitoklitik yetenek tayini gerçekleştirmek için hücre süspansiyonu karıştırın ve akış sitometrisi için hazırlığı tekrarlayın.
Deneye numune ve tüp eklemek için yeni numune düğmesini tıklatın. Metin protokolünde listelenen tüpleri adlandırın. Sitolitik töz için bir dağılım gating sistemi oluşturmak için, ilk tube bir seçin ve bir FSCA SSCA çizim oluşturmak için nokta çizim düğmesine tıklayın.
Hücre enkazını dışlamak için 50.000'den büyük bir FSCA eşiği olan tüm olayların üzerine dikdörtgen bir kapı çizin. Yeni nokta çizimi için SSCA CFSE parametresini seçin, ardından yeni nokta çizimi için 7-AAD CFSE parametresini seçin ve dört alt popülasyonu tanımlamak için dört çeyreklikli bir kapı çizin. Önce boş kontrol örneğini analiz etmek için yük örneği düğmesini tıklatın.
SSCA ve FSCA gerilimini ayarlayın. CFSE ve 7-AAD kanal parametrelerini kullanarak ölü hücre popülasyonunu belirleyin. Her numunede 20.000 CFSE pozitif hücreden daha fazla veri kaydedin.
Canlı olmayan hücre popülasyonlarını çözümlemek için her bir örneğin istatistiksel değerlerini içeren dosyaları açın ve verileri analiz dosyalarına aktarın. Sağlıklı donörlerden CD-3 pozitif CD56 pozitif T-hücrelerinin alt popülasyonunun analiz ine yönelik gating stratejisinin temsili sonuçları, üç bireyden gelen CIK oranının istatistiksel analizi ile gösterilmiştir. CD-3 pozitif CD56 pozitif hücre oranı 14 günlük genişlemeden sonra önemli ölçüde artmıştır.
Bu durum, 14. Bu kültür sisteminde, CIK hücreleri PBMCs orijinal sayısına göre yaklaşık yarım yüz kat değişiklikler verdi.
CIK ve CFSE pozitif hücrelerin boyutu ve tanecikleri gösterilmiştir. CFSE lekeli K562 hücreleri, cik hücreleri ile sıfırdan bire bire, beşe bir ve 10'a bir oranında birlikte tedavi edildi. Bu hücreler ölü hücre dışlanması için canlılık sondası olarak 7-AAD boyaile boyanmıştır.
CFSE pozitif K562 hücrelerinin 7-AAD pozitif hücrelerinin hepsi değerlendirildi. CFSE lekeli OC-3 hücreleri CIK hücreleri ile 10'a 1 oranında birlikte tedavi edildi. CIK'in OC-3 hücrelerine karşı belirgin sitotoksisitesi 24 saatlik kuluçka dan sonra burada gösterilmiştir.
CIK T-hücrelerinin kanser hücrelerine karşı önemli sitotoksik etkiler uyguladığı ve kanser tedavilerinde cerrahi, radyasyon ve kemoterapinin olumsuz etkilerini azalttığı bildirilmiştir. İmmünoterapi kanserlerin bir dizi için umut verici bir tedavi yöntemidir. CIK, daha fazla otolog infüzyon için GMP dereceli durumda hasta kaynaklı PMCB'lerin kuluçkaya yatarak invitro olarak verimli bir şekilde genişletilebilir.
Bu protokolü takiben, daha fazla klinik kanser tedavisi için GTP veya GMP dereceli bir tesiste bağışıklık hücreli tedavi uygulayabiliriz.
