Wir haben eine hochqualifizierte und klinisch anwendbare Methode zur Erweiterung von PBMC-abgeleiteten Cytokin-induzierten Killer-T-Zellen und zur Bewertung ihrer Zytotoxizität gegen Krebs optimiert. Der Vorteil dieser Technik besteht darin, ein Standard-Betriebsverfahren für Techniker und Kliniker bereitzustellen, um die Wirksamkeit von Zytokin-induzierten Killerzellen sowohl in der wissenschaftlichen Forschung als auch in der klinischen Bewertung zu quantifizieren. Beginnen Sie dieses Verfahren mit einer Vorbereitung von KIK-Zellen, wie im Textprotokoll beschrieben, und waschen Sie dann die CIK-Zellen mit 10 Milliliter sterilen PBS.
Zentrifuge für 10 Minuten bei 300 mal G und 18 bis 20 Grad Celsius. Aspirieren Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellen mit fünf MilliliterPBS. Zählen Sie die Zellzahlen und die Lebensfähigkeit der Testzelle mit dem Trypan-Blau-Ausschluss-Assay.
Aliquot die CIK-Zellen in sechs sterile 1,5 Milliliter-Röhren mit einer Dichte von etwa 5 bis 1 Million Zellen pro Milliliter PBS. Beschriften und behandeln Sie die Zellen wie im Textprotokoll beschrieben. Mischen Sie die CIK-Zellen vorsichtig mit den Antikörpern, indem Sie mindestens dreimal mit einer ein Milliliter sterilen Pipette vorsichtig nach oben und unten pfeifen.
Inkubieren Sie die Zellen für 15 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln. Zentrifugieren Sie die Rohre für 10 Minuten bei 300 mal G und 18 bis 20 Grad Celsius. Nach der Zentrifugation den Überstand ansaugen und das Zellpellet mit einem Milliliter PBS wieder aufhängen, die Zellen dann mindestens dreimal mit einer ein Milliliter sterilen Pipette auf- und abpfeifen.
Übertragen Sie die Zellsuspension auf ein steriles Fünf-Milliliter-Polystyrol-Rundbodenrohr mit einer Zellsiebkappe, indem Sie sanft durch die Kappe pfeifen, und legen Sie dann die Rohre auf das Karussell in Ordnung. Öffnen Sie die Flow-Zytometrie-Analysesoftware, und erstellen Sie einen experimentellen Ordner, und klicken Sie dann auf die neue Musterschaltfläche, um dem Experiment eine Probe und ein Rohr hinzuzufügen. Benennen Sie die im Textprotokoll aufgeführten Röhren.
Um ein Streuungs-Gating-System für die CIK-Zellenpopulationen zu erstellen, wählen Sie zuerst Rohr eins aus und klicken Sie auf die Schaltfläche Punktdiagramm, um ein FSCA-SSCA-Diagramm zu erstellen. Zeichnen Sie ein Rechtecktor über die gesamte Zellpopulation mit einem FSCA-Schwellenwert von mehr als 5000, um Zellablagerungen auszuschließen. Wählen Sie den FsCA FSCH-Parameter für das neue Punktdiagramm aus, und zeichnen Sie ein Polygontor um alle einzelnen Zellen.
Wählen Sie die Anzahl im Vergleich zu FITC-konjugierten CD3 und count versus APC-konjugated CD56 Parameter für das neue Histogramm-Plot. Wählen Sie den Parameter FITC-konjugierte CD3- oder APC-konjugierte CD56 für das neue Punktdiagramm aus, und zeichnen Sie ein Vier-Quadranten-Gate, um die vier Subpopulationen zu definieren. Zeichnen Sie die Daten von 20.000 Einzelzellen in jeder Probe auf.
Klicken Sie auf die Schaltfläche Beispiel laden, um das leere Steuerelementbeispiel zuerst zu analysieren. Identifizieren Sie die gesamte CIK-Zellpopulation mithilfe der Kanalparameter CD56 und CD3. Öffnen Sie die Dateien, die die statistischen Werte der einzelnen Probe enthalten, um CIK-Zellpopulationen zu analysieren, und drucken Sie sie in Analysedateien neu aus.
Um den zytotoxischen Assay, die Cokultur CIK und die chronische myeloische Leukämie K562-Zellen durchzuführen, indem jeweils ein Milliliter K562-Zellen in einer Sechs-Well-Platte mit einer Dichte von 5 Millionen Zellen pro Milliliter hinzugefügt werden, fügen Sie der im Textprotokoll aufgeführten Sechs-Well-Platte einen Milliliter Basalmedium mit oder ohne KIK-Zellen hinzu. Mischen Sie die Zellsuspensionen, indem Sie mindestens dreimal sanft nach oben und unten pfeifen. Legen Sie die Platte 24 Stunden lang in den Inkubator.
Nun, Cokultur CIK und Eierstock OC-3 Zellen durch Zugabe eines Milliliter Basalmedium mit oder ohne CIK-Zellen auf die Sechs-Well-Platte, wie im Textprotokoll aufgeführt. Mischen Sie die Zellsuspensionen, indem Sie mindestens dreimal sanft nach oben und unten pfeifen. Legen Sie die Platte für 24 Stunden in den Inkubator.
Nach der Inkubation die CIK K562 Zellsuspension direkt in ein 15 Milliliter steriles Rohr ernten. Um sowohl die Suspensions- als auch die Haftzellen aus den CIK OC-3-Gruppen zu ernten, übertragen Sie zunächst die Zellsuspension in ein 15 Milliliter steriles Rohr. Waschen Sie den Brunnen mit einem Milliliter sterilen PBS, sammeln Sie die PBS, und fügen Sie es in die Röhre, dann fügen Sie 5 Milliliter Zelldissoziationsenzymlösung und inkubieren für fünf Minuten bei 37 Grad Celsius.
Fügen Sie einen Milliliter der Lösung aus dem gleichen Rohr zum entsprechenden Brunnen hinzu und mischen Sie die Zellen vorsichtig, indem Sie mindestens dreimal mit einer ein Milliliter sterilen Pipette auf und ab pfeifen. Sammeln Sie alle Zellen in der gleichen Röhre. Zentrifuge bei 300 mal G für 10 Minuten.
Aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in einem Milliliter sterilen PBS wieder aus. Pellet die Zellen bei 300 mal G für 10 Minuten, dann aspirieren Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellen in 100 Mikroliter sterilen PBS. Fügen Sie der Zellsuspension fünf Mikroliter 7-AAD-Farbstoff hinzu.
Mischen Sie die Zellen vorsichtig, indem Sie mindestens dreimal mit einer ein Milliliter sterilen Pipette nach oben und unten pfeifen. 10 Minuten inkubieren und vor der Analyse im Dunkeln lassen. Um den Zytolytisch-Fähigkeitstest durchzuführen, mischen Sie die Zellsuspension und wiederholen Sie die Vorbereitung für die Durchflusszytometrie.
Klicken Sie auf die schaltfläche "Neue Probe", um dem Experiment eine Probe und ein Rohr hinzuzufügen. Benennen Sie die im Textprotokoll aufgeführten Röhren. Um ein Streuungs-Gating-System für den zytolytischen Assay zu erstellen, wählen Sie zuerst Rohr eins aus und klicken Sie auf die Punktplot-Schaltfläche, um ein FSCA-SSCA-Diagramm zu erstellen.
Zeichnen Sie ein Rechtecktor über alle Ereignisse mit einem FSCA-Schwellenwert von mehr als 50 000, um Zellablagerungen auszuschließen. Wählen Sie den Parameter SSCA CFSE für das neue Punktdiagramm aus, und wählen Sie dann den 7-AAD CFSE-Parameter für das neue Punktdiagramm aus, und zeichnen Sie ein Vier-Quadranten-Gate, um die vier Subpopulationen zu definieren. Klicken Sie auf die Schaltfläche Beispiel laden, um das leere Steuerelementbeispiel zuerst zu analysieren.
Stellen Sie die Spannung von SSCA und FSCA ein. Identifizieren Sie die Totzellenpopulation mithilfe der CFSE- und 7-AAD-Kanalparameter. Zeichnen Sie die Daten von mehr als 20.000 CFSE-positiven Zellen in jeder Probe auf.
Öffnen Sie die Dateien, die die statistischen Werte der einzelnen Proben enthalten, um die nicht lebensfähigen Zellpopulationen zu analysieren, und exportieren Sie die Daten in Analysedateien. Die repräsentativen Ergebnisse der Gating-Strategie zur Analyse der Subpopulation von CD-3-positiven CD56-positiven T-Zellen von gesunden Spendern werden mit der statistischen Analyse des CIK-Anteils von drei Individuen dargestellt. Der CD-3-positive CD56-Positive-Zellanteil stieg nach 14 Tagen Expansion deutlich an.
Dies zeigt sich an den 65 % für die ursprüngliche PBMC, die für die am 14. Tag geernteten KIK-Zellen auf 27,4 % angestiegen ist. In diesem Kultursystem ergaben die KIK-Zellen etwa ein halbes hundertfaches Changes im Vergleich zur ursprünglichen Anzahl von PBMCs. K562-Zellen wurden mit einem nicht fluoreszierenden Farbstoff CFSE gefärbt, der durch intrazelluläre Esterasen in lebensfähigen Zellen zerlegt wird und zu einem hochfluoreszierenden Farbstoff wird.
Die Größe und Granularität der CIK- und CFSE-positiven Zellen wird veranschaulicht. Die CFSE-gefärbten K562-Zellen wurden mit KIK-Zellen im Verhältnis von Null zu Eins, fünf zu eins und 10 zu eins kobehandelt. Diese Zellen wurden mit 7-AAD-Farbstoff als Lebensfähigkeitssonde für den Ausschluss toter Zellen gefärbt.
Die 7-AAD-positiven Zellen von CFSE-positiven K562-Zellen wurden alle ausgewertet. Die CFSE-gefleckten OC-3-Zellen wurden mit KIK-Zellen im Verhältnis 10 zu eins kobehandelt. Die offensichtliche Zytotoxizität von CIK gegen OC-3-Zellen wird hier nach 24 Stunden Inkubation nachgewiesen.
ES wurde berichtet, dass CIK-T-Zellen signifikante zytotoxische Wirkungen gegen Krebszellen ausüben und die Nebenwirkungen von Chirurgie, Bestrahlung und Chemotherapie bei Krebsbehandlungen reduzieren. Immuntherapie ist eine vielversprechende Behandlung für eine Reihe von Krebsarten. CIK kann in vitro durch Inkubation von patientenabgeleiteten PMBCs in GMP-Zustand für weitere autologen Infusionen effizient erweitert werden.
Nach diesem Protokoll konnten wir die immunzelluläre Therapie in einer GTP- oder GMP-Einrichtung zur weiteren klinischen Krebsbehandlung durchführen.
