우리는 PBMC 유래 사이토카인 유도 킬러 T 세포의 확장및 암에 대한 그들의 세포 독성의 평가를 위한 고도의 자격을 갖춘 임상적으로 적용 가능한 방법을 최적화했습니다. 이 기술의 장점은 기술자와 임상의가 과학적 연구와 임상 평가 모두에서 사이토카인 유발 킬러 세포의 효능을 정량화하는 표준 수술 절차를 제공하는 것입니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 CIK 세포의 준비로 이 절차를 시작한 다음 멸균 PBS의 10 밀리리터로 CIK 세포를 세척하십시오.
원심분리기는 G 300배, 섭씨 18~20도에서 10분 간 사용할 수 있습니다. 슈퍼 나티퍼를 흡인하고 PBS의 5 밀리리터로 세포를 재일시 중단합니다. trypan 블루 제외 분석기를 사용하여 셀 번호 와 테스트 셀 생존 가능성을 계산합니다.
Aliquot는 PBS의 밀리리터 당 약 5 ~1백만 개의 세포의 밀도로 6개의 멸균 된 1.5 밀리리터 튜브로 CIK 세포를 인용합니다. 텍스트 프로토콜에 셀에 대한 레이블을 지정하고 자세히 설명합니다. CIK 세포를 항체와 부드럽게 섞어 적어도 세 번 위아래로 부드럽게 피펫을 1 밀리리터 멸균 파이펫으로 섞는다.
어둠 속에서 실온에서 15 분 동안 세포를 배양하십시오. 튜브를 300배, 섭씨 18~20도에서 10분간 원심분리합니다. 원심 분리에 따라, 슈퍼나탄을 흡인하고 PBS의 1 밀리리터로 셀 펠릿을 재연한 다음, 1밀리리터 멸균 파이펫으로 적어도 세 번 이상 세포를 부드럽게 피펫합니다.
셀 서스펜션을 셀 스트레이너 캡으로 멸균 5 밀리리터 폴리스티렌 라운드 하단 튜브로 부드럽게 캡을 통과한 다음 튜브를 회전 목마에 순서대로 놓습니다. 유동 세포 분석 분석 소프트웨어를 열고 실험 폴더를 만든 다음 새 시편 버튼을 클릭하여 실험에 표본과 튜브를 추가합니다. 텍스트 프로토콜에 나열된 튜브의 이름을 지정합니다.
CIK 셀 채우기에 대한 분산 게이팅 시스템을 만들려면 먼저 튜브 를 선택하고 점 플롯 버튼을 클릭하여 FSCA SSCA 플롯을 만듭니다. FSCA 임계값이 5000보다 큰 전체 세포 집단에 사각형 게이트를 그려 세포 이물질을 제외합니다. 새 점 플롯에 대한 FSCA FSCH 매개변수를 선택하고 모든 단일 셀 주위에 다각형 게이트를 그립니다.
새로운 히스토그램 플롯에 대한 FITC-컨쥬게이트 CD3 대 카운트를 선택하고 APC-컨쥬게이트 CD56 매개변수와 비교합니다. 새로운 점 플롯에 대한 FITC-컨쥬게이트 CD3 대 APC-접합 CD56 매개변수를 선택하고 4개의 하위 모집단을 정의하기 위해 4개의 사분면 게이트를 그립니다. 각 시편에서 20, 000 개의 단일 세포에서 데이터를 기록합니다.
로드 샘플 버튼을 클릭하여 빈 컨트롤 샘플을 먼저 분석합니다. CD56 및 CD3 채널 매개변수를 사용하여 전체 CIK 셀 집단을 식별합니다. 개별 표본의 통계 값이 포함된 파일을 열어 CIK 셀 모집단을 분석하고 분석 파일로 다시 인쇄합니다.
세포독성 분석, 공동 배양 CIK 및 인간 만성 골수성 백혈병 K562 세포를 밀리리터당 500만 개의 밀도로 6웰 플레이트에 각각 K562 세포의 1밀리리터를 첨가한 다음, 텍스트 프로토콜에 기체 세포가 있거나 없는 기저 배지 1밀리리터를 추가한다. 셀 서스펜션을 세 번 이상 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 혼합합니다. 플레이트를 인큐베이터에 24시간 동안 배치합니다.
지금, 문자 프로토콜에 나열된 바와 같이 6웰 플레이트에 CIK 세포의 유무에 관계없이 기저 배지의 1밀리리터를 추가하여 CIK 및 난소 OC-3 세포를 공동 배양한다. 셀 서스펜션을 세 번 이상 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 혼합합니다. 플레이트를 인큐베이터에 24시간 동안 넣습니다.
인큐베이션에 이어 CIK K562 셀 서스펜션을 15밀리리터 멸균 튜브로 직접 수확한다. CIK OC-3 그룹에서 서스펜션 및 준수 세포를 모두 수확하기 위해 먼저 세포 현탁액을 15 밀리리터 멸균 튜브로 이송합니다. 멸균 PBS의 1 밀리리터로 잘 씻고, PBS를 수집하고 튜브에 추가한 다음, 세포 해리 효소 용액 5 밀리리터를 추가하고 섭씨 37도에서 5분간 배양합니다.
동일한 튜브에서 용액 1밀리리터를 해당 우물에 넣고, 1밀리리터 멸균 파이펫으로 적어도 세 번 이상 피펫팅하여 세포를 부드럽게 섞는다. 동일한 튜브의 모든 세포를 수집합니다. 원심분리기는 10분 동안 300배 G로 합니다.
슈퍼 네티미터를 흡인하고 멸균 PBS의 1 밀리리터에서 세포를 재일시 중단합니다. 10 분 동안 300 배 G에서 세포를 펠릿 한 다음 수퍼 나탄을 흡인하고 멸균 PBS의 100 마이크로 리터에서 세포를 다시 중단합니다. 세포 현탁액에 7-AAD 염료 5개를 추가합니다.
적어도 세 번 이상 1밀리리터 멸균 파이펫으로 피펫팅하여 세포를 부드럽게 섞는다. 10 분 동안 배양하고 분석하기 전에 어둠 속에서 둡니다. 세포분석 기능을 수행하려면 세포 현탁액을 혼합하고 혈류 세포측정에 대한 준비를 반복한다.
새 표본 버튼을 클릭하여 실험에 표본과 튜브를 추가합니다. 텍스트 프로토콜에 나열된 튜브의 이름을 지정합니다. 세포 분석기에 대한 분산 게이팅 시스템을 만들려면 먼저 튜브 를 선택하고 점 플롯 버튼을 클릭하여 FSCA SSCA 플롯을 만듭니다.
FSCA 임계값이 50, 000보다 큰 모든 이벤트에 직사각형 게이트를 그려 셀 이물질을 제외합니다. 새 점 도면에 대한 SSCA CFSE 매개변수를 선택한 다음 새 도트 플롯에 대한 7-AAD CFSE 매개 변수를 선택하고 4개의 하위 모집단을 정의하기 위해 4개의 사분면 게이트를 그립니다. 로드 샘플 버튼을 클릭하여 빈 컨트롤 샘플을 먼저 분석합니다.
SSCA 및 FSCA의 전압을 조정합니다. CFSE 및 7-AAD 채널 매개변수를 사용하여 죽은 세포 집단을 식별합니다. 각 시편에서 20, 000 CFSE 양성 셀보다 큰 데이터를 기록합니다.
각 개별 표본의 통계 값을 포함하는 파일을 열어 실행 불가능한 셀 모집단을 분석하고 데이터를 분석 파일로 내보냅니다. 건강한 기증자로부터 CD-3 양성 CD56 양성 T세포의 하위집단을 분석하기 위한 게이팅 전략의 대표적인 결과는 3명의 개인으로부터 CIK 비율의 통계적 분석과 함께 나타난다. CD-3 양성 CD56 양수 셀 비율은 확장 14일 후에 크게 증가했습니다.
이는 14일 수확한 CIK 세포의 경우 27.4%로 증가한 원래 PBMC의 경우 65%를 통해 분명하게 드러난다. 이러한 배양 시스템에서, CIK 세포는 원래 의 PBMC 수에 비해 약 반백 배의 변화를 산출하였다. K562 세포는 비형성 염료 CFSE로 염색되었고, 이는 실행 가능한 세포 내 세포 내 에스테라아에 의해 갈라져 매우 형광염이 된다.
CIK 및 CFSE 양성 세포의 크기와 세분성이 도시되어 있습니다. CFSE 염색 K562 세포는 0 대 1, 5 대 1, 10 대 1의 비율로 CIK 세포와 공동 처리되었다. 이 세포는 죽은 세포 배제를 위한 생존 성 프로브로 7-AAD 염료로 염색되었다.
CFSE 양성 K562 세포의 7-AAD 양성 세포는 모두 평가되었다. CFSE 염색 OC-3 세포는 10 대 1의 비율로 CIK 세포와 공동 처리되었다. OC-3 세포에 대한 CIK의 명백한 세포 독성은 24 시간의 인큐베이션 을 통해 여기에서 입증됩니다.
CIK T 세포는 암세포에 대하여 중요한 세포 독성 효력을 발휘하고 암 처리에 있는 수술, 방사선 및 화학요법의 부작용을 감소시키기 위하여 보고되었습니다. 면역 요법은 다수의 암에 대한 유망한 치료법입니다. CIK는 추가 자가 주입을 위해 GMP 급 조건에서 환자 유래 PMBCs의 인큐베이션에 의해 시험관 내에서 효율적으로 확장될 수 있다.
이 프로토콜에 따라, 우리는 추가 임상 암 처리를 위한 GTP 또는 GMP 급 시설에서 면역 세포 치료를 실행할 수 있었습니다.
