אנחנו אופטימיזציה שיטה מוסמכת מאוד וישימה קלינית להרחבת PBMC נגזר ציטוקין רוצח תאי T ולהערכת הציטוקוקסיות שלהם נגד סרטן. היתרון של טכניקה זו הוא לספק הליך פעולה סטנדרטי עבור טכנאים וקלינאים לכמת את העוצמה של תאים הרוצח הנגרמת על ידי ציטוקינים במחקר מדעי והערכה קלינית. התחל הליך זה עם הכנה של תאי CIK כמתואר בפרוטוקול הטקסט, ולאחר מכן לשטוף את התאים CIK עם 10 מיליליטר של PBS סטרילי.
צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 300 פעמים G ו 18 עד 20 מעלות צלזיוס. שאף את העל-טבעי והשקיע מחדש את התאים בחמישה מיליליטר של PBS. ספור את מספרי התאים ובדוק את יכולת הקיום של התא באמצעות הבדיקה של אי-הכללה כחולה של trypan.
Aliquot תאי CIK לתוך שישה צינורות סטריל 1.5 מיליליטר בצפיפות של כ 5 עד 1 מיליון תאים למיליליטר של PBS. סמן את התאים בתווית והתייחס אליהם כמפורט בפרוטוקול הטקסט. מערבבים בעדינות את תאי CIK עם הנוגדנים על ידי צינורות בעדינות למעלה ולמטה לפחות שלוש פעמים עם פיפטה סטרילית אחת מיליליטר.
דגירה התאים במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. צנטריפוגה הצינורות במשך 10 דקות ב 300 פעמים G ו 18 עד 20 מעלות צלזיוס. לאחר צנטריפוגה, שאף את supernatant ו resuspend גלולת התא עם מיליליטר אחד של PBS, ולאחר מכן בעדינות pipette את התאים למעלה ולמטה לפחות שלוש פעמים עם פיפטה סטרילית מיליליטר אחד.
העבר את ההשעיה התא סטרילי חמישה מיליליטר צינור תחתון עגול פוליסטירן עם כובע מסננת תא על ידי צינור בעדינות דרך הכובע, ולאחר מכן למקם את הצינורות על הקרוסלה כדי. פתח את תוכנת ניתוח cytometry זרימה וליצור תיקיית ניסוי, ולאחר מכן לחץ על כפתור הדגימה החדש כדי להוסיף דגימה צינור לניסוי. תן שם לצינורות כמפורט בפרוטוקול הטקסט.
כדי ליצור מערכת פיזור gating עבור אוכלוסיות תא CIK, בחר תחילה צינור אחד ולחץ על כפתור התוויית נקודה כדי ליצור התוויית SSCA FSCA. צייר שער מלבן מעל כלל אוכלוסיית התאים עם סף FSCA הגדול מ- 5000 כדי לא לכלול פסולת תאים. בחר בפרמטר FSCA FSCH עבור התוויית הנקודה החדשה וצייר שער מצולע מסביב לכל התאים הבודדים.
בחר את הספירה לעומת CD3 נדן FITC וספירה לעומת פרמטר CD56 נדמד APC עבור התוויית היסטוגרמה חדשה. בחר בפרמטר CD3 ההצטייד ב- FITC לעומת פרמטר CD56 ההצטייד ב- APC עבור התוויית הנקודה החדשה וצייר שער של ארבעה רבעים כדי להגדיר את ארבעת תתי-התתי-התיקיות. רשום את הנתונים מ- 20,000 תאים בודדים בכל דגימה.
לחץ תחילה על לחצן דוגמת הטעינה כדי לנתח תחילה את דוגמת הפקד הריק. זהה את כל אוכלוסיית התאים של CIK באמצעות הפרמטרים של ערוץ CD56 ו- CD3. פתח את הקבצים המכילים את הערכים הסטטיסטיים של הדגימה הבודדת כדי לנתח אוכלוסיות תאים של CIK ולהדפיס אותן מחדש בקבצי ניתוח.
כדי לבצע את ההתמדה cytotoxic, coculture CIK ולוקמיה מיאלואידית כרונית אנושית K562 תאים על ידי הוספת מיליליטר אחד של תאים K562 לכל באר בצלחת שש באר בצפיפות של 5 מיליון תאים למיליליטר, ולאחר מכן להוסיף מיליליטר אחד של מדיום בסיסי עם או בלי תאי CIK לצלחת שש באר כפי שמפורט בפרוטוקול הטקסט. מערבבים את מתלי התא על ידי צינור בעדינות למעלה ולמטה לפחות שלוש פעמים. מניחים את הצלחת באינקובטור במשך 24 שעות.
עכשיו, coculture CIK ותאי OC-3 השחלות על ידי הוספת מיליליטר אחד של מדיום בסיס עם או בלי תאי CIK לצלחת שש בארות כפי שמפורט בפרוטוקול הטקסט. מערבבים את מתלי התא על ידי צינור בעדינות למעלה ולמטה לפחות שלוש פעמים. שים את הצלחת באינקובטור במשך 24 שעות.
לאחר הדגירה, לקצור את ההשעיה תא CIK K562 ישירות לתוך צינור סטרילי 15 מיליליטר. כדי לקצור הן את תאי ההשעיה והן את תאי הדבקה מקבוצות CIK OC-3, העבר תחילה את השעיית התא לצינור סטרילי של 15 מיליליטר. לשטוף את הבאר עם מיליליטר אחד של PBS סטריל, לאסוף את PBS, ולהוסיף אותו לצינור, ולאחר מכן להוסיף 5 מיליליטר של פתרון אנזים דיסוציאציה התא דגירה במשך חמש דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
מוסיפים מיליליטר אחד של הפתרון מאותה צינור ל באר המתאימה, ומערבבים בעדינות את התאים על ידי צינור למעלה ולמטה לפחות שלוש פעמים עם פיפטה סטרילית מיליליטר אחד. לאסוף את כל התאים באותו צינור. צנטריפוגה ב 300 פעמים G במשך 10 דקות.
שאף את העל-טבעי והשקיע מחדש את התאים במיליליטר אחד של PBS סטרילי. גלול את התאים ב 300 פעמים G במשך 10 דקות, ולאחר מכן שאף את supernatant ו resuspend התאים ב 100 microliters של PBS סטרילי. הוסף חמישה microliters של צבע 7-AAD לתליית התא.
מערבבים בעדינות את התאים על ידי צינור למעלה ולמטה לפחות שלוש פעמים עם פיפטה סטרילית מיליליטר אחד. דגירה במשך 10 דקות ולהשאיר בחושך לפני הניתוח. כדי לבצע את בדיקת היכולת הציטוליטית, מערבבים את מתלי התא וחוזרים על ההכנה לציטומטריית זרימה.
לחץ על כפתור הדגימה החדש כדי להוסיף דגימה וצינור לניסוי. תן שם לצינורות כמפורט בפרוטוקול הטקסט. כדי ליצור מערכת פיזור gating עבור המבחן cytolytic, תחילה לבחור צינור אחד ולחץ על כפתור התוויית נקודה כדי ליצור התוויית SSCA FSCA.
צייר שער מלבן מעל כל האירועים עם סף FSCA הגדול מ- 50, 000 כדי לא לכלול פסולת תאים. בחר בפרמטר CFSE של SSCA עבור התוויית הנקודה החדשה ולאחר מכן בחר בפרמטר CFSE של 7-AAD עבור התוויית הנקודה החדשה וצייר שער של ארבעה רבעים כדי להגדיר את ארבעת תת-המכפלות. לחץ תחילה על לחצן דוגמת הטעינה כדי לנתח תחילה את דוגמת הפקד הריק.
כוונן את המתח של SSCA ו- FSCA. זהה את אוכלוסיית התאים המתים באמצעות הפרמטרים CFSE ו- 7-AAD ערוץ. רשום את הנתונים מ גדול מ- 20, 000 תאים חיוביים CFSE בכל דגימה.
פתח את הקבצים המכילים את הערכים הסטטיסטיים של כל דגימה בודדת כדי לנתח את אוכלוסיות התאים שאינם ניתנים לשחזור, וייצא את הנתונים לקבצי ניתוח. התוצאות הייצוגיות של אסטרטגיית gating לניתוח תת-התפקוד של CD-3 חיובי CD56 חיובי T-תאים מתורמים בריאים מוצגים עם ניתוח סטטיסטי של שיעור CIK משלושה אנשים. CD-3 חיובי CD56 שיעור התא החיובי גדל באופן משמעותי לאחר 14 ימים של התרחבות.
הדבר ניכר באמצעות 65% עבור PBMC המקורי אשר עלה ל 27.4% עבור תאי CIK שנקטפו ביום 14. במערכת תרבות זו, תאי CIK הניבו כחצי מאה שינויים לקפל בהשוואה למספר המקורי של PBMCs. תאים K562 היו מוכתמים עם CFSE צבע nonfluorescent, אשר מחשוף על ידי אסטראזים תאיים בתוך תאים קיימא הופך צבע פלואורסצנטי מאוד.
הגודל והצפיפות של התאים החיוביים CIK ו- CFSE מודגמים. תאי K562 מוכתמים ב- CFSE טופלו במשותף בתאי CIK ביחס של אפס לאחד, חמישה לאחד ו- 10 לאחד. תאים אלה היו מוכתמים בצבע 7-AAD כגשוש כדאיות להדרת תאים מתים.
התאים החיוביים 7-AAD של תאי K562 חיוביים CFSE הוערכו כולם. תאי ה- OC-3 המוכתמים ב- CFSE טופלו במשותף בתאי CIK ביחס של 10 לאחד. הציטוקקסיות הברורה של CIK נגד תאי OC-3 מוכחת כאן לאחר 24 שעות של דגירה.
CIK T-תאים דווח להפעיל השפעות cytotoxic משמעותי נגד תאים סרטניים ולהפחית את ההשפעות השליליות של ניתוח, הקרנות, וכימותרפיה בטיפולים בסרטן. אימונותרפיה היא טיפול מבטיח עבור מספר סוגי סרטן. CIK ניתן להרחיב ביעילות במבחנה על ידי דגירה של PMBCs שמקורם בחולה במצב GMP כיתה עבור עירוי אוטולוגי נוסף.
בעקבות פרוטוקול זה, אנו יכולים לבצע את הטיפול התאי החיסוני במתקן GTP-או GMP כיתה לטיפול נוסף בסרטן קליני.
